发布时间：2019-08-07所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要：利用室内流水式粘油砾石柱模拟实际环境中的海底重燃油,研究了重燃油污染的孔隙水对成年海胆繁殖力、配子质量及子代胚胎发育的影响. 结果表明,暴露结束后(7d),暴露组海胆的排配子率显著降低(P=0.033),同时雌海胆繁殖力也显著降低(P=0.036,(195791781147
摘要：利用室内流水式粘油砾石柱模拟实际环境中的海底重燃油,研究了重燃油污染的孔隙水对成年海胆繁殖力、配子质量及子代胚胎发育的影响. 结果表明,暴露结束后(7d),暴露组海胆的排配子率显著降低(P=0.033),同时雌海胆繁殖力也显著降低(P=0.036,(1957917±811471)个卵细胞);卵细胞的直径和精子的受精能力并未受到海底重燃油的影响.子代继续暴露 48h,发现亲代暴露加剧了子代胚胎畸形程度,表明亲代暴露的毒性可传递给子代.进一步利用整合毒性指数(ITI)检测毒性传递的性别差异发现,与母本效应相比(24 和 48h 子代的 ITI 分别为 0.54~1.45 和 1.1~2.57),父本效应(24 和 48h 子代的 ITI 分别为 0.82~1.95 和 1.89~4.04)在毒性传递过程中起着关键作用.
关键词：海底重燃油;孔隙水;亲本效应;海胆;早期发育
1970~2016 年间,世界范围内,发生了超过 1000 起船舶溢油事故,其中绝大多数事故(81%)为小型船舶溢油事故(即溢油量<7t)[1].中小型船舶溢油事故泄漏的油品往往是重燃油(HFO),其导致的 HFO 溢出量占 HFO 总溢出量的 80%以上[2].HFO 是一种原油精炼产品.HFO 黏度大(15℃运动黏度 5000~ 30000mPa·s),分散和自然降解十分困难.在风浪作用下,HFO 可以出现在距溢油事故发生地点相当远的地方,使海岸线和敏感海域受到污染[3].此外,HFO 密度较高(0.92~1.02g/cm3 ),在碎波带与泥沙混合后,更易于沉降.沉降后,在波浪和潮汐的作用下 HFO 可以在水体和砂砾海滩之间循环,源源不断地释放多环芳烃(PAHs)对水生生物产生毒害作用,这个过程就是孔隙水毒性假说[4].
已有学者在实验室条件下利用装填粘油砾石的容器模拟近岸处海底 HFO,发现鱼类胚胎的畸形率和死亡率与流经粘油砾石的水体中 PAHs 浓度相关[5-9]. 事实上,海洋底栖生物,由于栖息在海底,不仅会暴露在有毒孔隙水中,还可能与海底 HFO 直接接触,加之其活动能力低下难以逃出污染区,势必会受到海底 HFO 的胁迫,因此海底 HFO 对海洋底栖生物的毒性影响亟待研究.
海胆主要栖息于浅海的岩礁、砾石、砂石等海底,对浅海生物群落的组成、结构和多样性起着关键的作用[10-13].海胆生活史包括浮游幼体和底栖成体两个主要阶段.不仅早期浮游幼体对污染敏感性高 [14-21],其成年阶段也被视作海洋生态毒理学研究和环境监测的有效生物模型[22-26].成年动物的繁殖能力对整个物种的延续起着至关重要的作用,海底 HFO 对成年海胆的毒害作用势必会影响到其体内配子的生成、排放、受精过程,进一步影响子代发育, 从而对整个种群的生存产生影响[27-34].
本文以装填粘油砾石的容器模拟海底 HFO,选择海洋底栖模式生物海胆为受试生物,研究海底 HFO 对亲代成年海胆繁殖能力、配子质量及其子代胚胎早期发育的影响.以期为评估溢油对海胆种群数量的影响提供参考数据,同时为海洋生态风险评估、自然资源损害评估以及船舶溢油索赔提供重要科学依据.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验油品 HFO380,运动黏度 729800mPa·s (50℃),密度 0.9821g/cm3,由大连海洋燃油有限公司提供. 1.1.2 实验砾石 直径为 10~50mm 的表面平整的砾石,取自大连银沙滩,洗净烘干后备用.
1.1.3 实验海水 取自大连市星海湾,盐度(34±1) PSU,pH=(8.0±0.03).
1.1.4 实验海胆驯化 繁殖期成年海胆购自大连海宝渔业有限公司.每只海胆注射 0.5mL 的 KCl,排黄色配子的为雌海胆,排白色配子的为雄海胆.将成功排配子的海胆在实验室海水循环系统(大连汇锌钛设备)中驯化 2 周,海水温度为(18±1)°C,光照周期为 12h:12h.期间每 3d 投喂海胆体重 5%的新鲜海带.暴露实验开始前 3d 停止喂食.驯化期间未出现自发排配子和死亡个体.
1.2 方法
1.2.1 粘油砾石制备[5,7,9] 将一定量的 HFO380 与 1.8kg 洁净砾石放入混合容器中剧烈晃动 2min,使油尽可能的均匀的覆盖在砾石表面.为避免相互干扰, 按粘油量由低至高依次制备不同浓度的粘油砾石. 然后将粘油砾石置于避光通风处 24h,用于暴露实验. 实验设置粘油砾石浓度为 0,400,800,1600,3200 和 6400μg 油/g 砾石(下文简写为 μg/g).0μg/g 为对照组.Zhadan 和 Vaschenko 的研究[33]表明暴露于被柴油污染的海水中 ( 总石油烃 (TPH) 浓 度 约 为 300μg/L)50d 的雌海胆所产子代的畸形率增加;在此基础上,通过预实验本文选择 400μg/g 浓度组为最低浓度组,该组暴露液中 TPH 浓度从 618.5μg/L 降至 308.6μg/L.进一步预实验发现,暴露于 16000μg/g 浓度组的雌海胆 2d 后出现自发排卵现象.暴露于 8000 和 4000μg/g 浓度组的雌海胆,在 7d 暴露期内未出现自发排卵现象,但是 8000μg/g 浓度组的雌海胆排卵数 目 少 . 不 足 以用于后 续子代 的暴露实验 , 而 4000μg/g 组的雌海胆产卵数量足以用于后续实验. 因 此 本文最 高浓度组的粘油量 应 介 于 4000~ 8000μg/g 之间.因此本文选择 400,800,1600,3200 和 6400 μg/g,以此保证可以观察到亲代效应,并保证有足够的卵细胞用于后续暴露实验.
1.2.2 动态暴露装置 装置为上下加盖的聚氯乙烯(PVC)柱(d=10.8cm,H=35cm),距底部 3cm 处有一进水管(d=1.2cm),出水管(d=1.2cm)位于对面距顶部 3cm 处,底部配备一个由 PVC 支柱(H=3.5cm)支撑的 PVC 网孔圆板放置砾石(图1).进水流速以针阀控制. 粘油砾石制备完成后,转移至该装置,海水流速 20mL/min 由下至上流经粘油砾石柱,24h 后盛接流出液进行暴露实验.
1.2.3 亲代海胆暴露方法每个浓度组设置 3 个重复,每个重复包括 6 只雌海胆和 6 只雄海胆,雌雄海胆分开暴露(图 1).暴露容器上部开孔,保证暴露溶液体积为 6L.暴露时间为 7d,暴露期间不充气不喂食, 并虹吸出容器底部排泄物.
1.2.4 子代胚胎获取及暴露方法 亲代海胆暴露结束后,用 0.45μm 滤膜过滤海水(FSW)清洗体表,然后经围口膜向海胆体腔内注射 1mL 现配的 KCl 溶液(0.5M).雌海胆口面向上置于盛满 FSW 锥形瓶口处,雄海胆口面向上,擦干体表后置于干燥的培养皿上.30min后将雌海胆取下,将每重复组6只雌海胆所产卵细胞混合,置于18℃的FSW中暂放待受精.每重复组的 6 只雄海胆所排精子混合后置于 4℃待受精. 取 10μL 干精子稀释于 5mL 的 FSW 中,加入到 500mL密度为100个/mL的卵细胞溶液中,轻轻晃动进行受精[35].胚胎亲本组合有4种(如图2所示):对照组(对照组卵细胞和对照组精子受精),母本暴露组 (暴露组卵细胞和对照组精子受精),父本暴露组(对照组卵细胞和暴露组精子受精)和双本暴露组(暴露组卵细胞和同组精子受精).受精 15min 后,虹吸法洗卵 3 次以去除多余的精子.
来自于暴露亲本的胚胎暴露浓度与其亲代暴露浓度相同.对照组胚胎均分为 6 份,分别于 FSW 和粘油砾石柱流出液中培养.因此对于子代暴露实验, 共有 5 个暴露浓度,每个浓度组包括 4 种亲本组合的胚胎.胚胎于黑暗处(18±1)℃的水浴中培养,期间无需换水和喂食.
1.2.5 亲代海胆相关参数测定 排配子率指排配子的雌或雄海胆个数与对应性别的海胆总数的比值.繁殖力指雌海胆开始排卵的 30min 内排出的卵的个数[36],其中将未排卵的雌海胆繁殖力记为 0.卵细胞计数使用 0.1mL 的浮游生物计数框进行,每只海胆重复计数 4 次并取平均值作为一只海胆的繁殖力.
1.2.6 配子质量 将每重复组 6 只雌海胆的卵细胞混合,取 3 个 1mL 重复样品,滴入几滴 40%福尔马林,置于 4℃待测.显微镜(OLYMPUS IX73)观测并拍照,使用 Cell Standard 软件测量卵细胞直径,每个样品至少测量 100 个卵细胞.于受精 15min 后取 3 个 1mL重复样品,加入几滴40%福尔马林置于4℃待观察受精率.以受精膜鼓起为受精成功标志,每个样品至少观察 100 个受精卵.
1.2.7 子代海胆胚胎早期发育观察 分别于受精后 24h(原肠胚期)和 48h(长腕幼虫期)取样,每重复组各取 4 个 2mL 重复样品并滴入 40%福尔马林放于 4 ℃, 在24h 内完成观察,并记录畸形率.正常发育的胚胎形态应满足 4 个条件[37-38]:(1)胚胎在受精后 24h 进入原肠胚时期,受精后 48h 进入长腕幼虫期;(2)胚胎呈现左、右和背、腹侧对称;(3)原肠期具备发育良好的原肠,长腕幼虫期具备结构完整的消化道(口、胃、肠);(4) 长腕幼虫期具备发育良好的骨针和腕.
1.2.8 综合毒性指数(ITI)[35] 根据发育是否延迟和形态是否畸形,每个胚胎赋予从 0~10 不同分值.24h 正常晚期原肠胚为 0 分,原肠胚、囊胚和桑椹胚各得 1,3 和 4 分;当胚胎出现畸形形态时,原肠胚、囊胚和桑椹胚各得 5,7 和 10 分.48h 正常长腕幼虫为 0 分,早期长腕幼虫、棱柱幼虫、原肠胚、囊胚和桑椹胚各得 2,3,4,5 和 5.5 分;当胚胎出现畸形形态时, 长腕幼虫、早期长腕幼虫、棱柱幼虫、原肠胚、囊胚和桑椹胚各得 6,7,7.5,8,9 和 10 分.ITI 根据以下公式计算:
10 ITI ( )/100 n i i i S F = = ? ∑ (1)
式中:Si 为每类畸形胚胎得分;Fi 为这类胚胎出现的频率(i=10).
1.2.9 暴露溶液组分分析方法 暴露期间每隔 24h 取水样分析暴露液 TPH 浓度和 PAHs 浓度. TPH 采用紫外法测定(BIOTEK EPOCH2)[39].各浓度组各取 3 个混合流出液重复样品,正己烷萃取,并于 225nm 下正己烷调零测定吸光度.根据以下标准曲线公式计算 TPH 浓度:
y = 0.051x-0.0033 (2)
式中:y 为样品萃取液吸光度与正己烷吸光度差值;x 为萃取液 TPH 浓度,mg/L;R2 =0.9996.
PAHs 浓度采用气相色谱/质谱联用法(GC/MS) 测定.样品前处理步骤参照 GB/T 21247-2007《海面溢油鉴别系统规范》[40].仪器型号 GC(HP 6890GC)- MS(5975),选择SIM模式,内标法进行定量分析.色谱柱 为 DB-5MSUI, 长 30m, 内 径 0.32mm, 膜 厚 度 0.25μm.载气为高纯氮气,流量 1mL/min.升温程序:50℃保持 2min,以 8℃/min 的速度升温至 150℃, 保持 3min;再以 3℃/min 速度升温至 300℃,保持 15min.分析 16 种 PAHs:萘,苊烯,苊,芴,菲,蒽,荧蒽,芘, 苯并[a]蒽,苯并[b]荧蒽,苯并[k]荧蒽,苯并[a]芘,茚并 [1,2,3-cd]芘,二苯并[a,h]蒽,苯并[ghi]芘.
1.2.10 数据统计分析 所有生物测定结果均以 3 个重复组测定值的(平均值±标准差)表示.采用 SPSS 19.0 软件进行数据的正态性检验(Shapiro–Wilk 法) 和方差同质性检验(Levene 法).若数据满足以上条件则进行方差分析,事后检验方法采用 Tukey HSD, 若方差不齐则事后检验采用 Dunnett 法.若数据不满足以上 2 个条件,则采用非参数检验的 Kruskal Wallis 法和 Mann Whitney 法进行显著性差异分析. 不同发育时期之间的差异采用配对 T 检验法. P<0.05 表示差异显著.TPH 浓度为 3 个重复样品的 (平均值±标准差),使用 OriginPro 软件对 TPH 浓度和 PAHs 浓度进行拟合.
2 结果与讨论
2.1 暴露溶液组分分析
2.1.1 TPH 浓度随时间和砾石粘油量的变化 粘油砾石柱是一种模拟近岸处沉降溢油的动态系统 [41].结果表明随着海水流经粘油砾石柱,所有浓度组的流出液中的 TPH 浓度呈指数形式降低,并具有良好相关性(R2 >0.95)(见表 1).这与溢油事故发生后实际测得的近岸处海水 TPH 浓度变化趋势一致[42]. 此外,根据拟合公式可对毒性进行定量表征,克服了动态暴露系统中暴露溶液浓度难以预测的缺点.
分析不同粘油量砾石柱在经海水冲洗相同时间后流出液中 TPH 浓度变化,发现 TPH 浓度与砾石粘油量呈正相关(R2 >0.84)(见表 2).
2.1.2 PAHs 随时间的变化及其与 TPH 的关系 亲代海胆暴露期间溶液中 PAHs 浓度逐渐减小,并且各种组分之间的相对含量也有所变化.例如,6400μg/g 组暴露溶液中的 PAHs 含量在亲代暴露期间由最初的 13.140μg/L 降低到结束时的 3.530μg/L.开始暴露时,暴露溶液中最主要的 PAHs 为萘(84.4%),其次为菲(7.3%).萘的分子量相对低且易挥发,暴露结束时萘的含量仅占了 38.2%,菲的相对含量增加到了 27.5%[7].6400μg/g 组粘油砾石上的 PAHs 浓度由 9.806μg/g 降低到了 6.408μg/g,各组分的相对含量也发生改变,萘相对含量由28.4%降低到15.8%,而菲的相对含量由 23.1%升高到 28.2%.
通过分析 6400μg/g 组暴露溶液中 PAHs 浓度及其对应的 TPH 浓度在 7d 内的变化趋势,发现尽管 PAHs 的各种组分相对含量有所不同,但是 PAHs 浓度和 TPH 浓度在暴露期间呈现良好相关性(R2 = 0.866).考虑到 TPH 浓度与砾石粘油量呈良好相关性,因此本文中毒性均以砾石粘油量进行对比分析.
2.2 对亲代海胆生长繁殖的影响
暴露在粘油砾石柱流出液中 7d 后,海胆排配子率显著降低(Kruskal-Wallis,P=0.033).粘油砾石对海胆排配子率的影响无性别差异性(Mann Whitney, P>0.05).另外,与对照组相比((5551667±714587)个卵细胞),6400μg/g 组雌海胆排卵数量减少((1957917± 811471)个卵细胞),繁殖力显著降低(1-way ANOVA, P=0.036),表明粘油砾石流出液 7d 暴露影响了海胆的繁殖状态.这可能与压力环境下海胆性腺内性细胞再吸收作用相关,性细胞的再吸收可以使海胆将更多的能量分配到细胞解毒和保护过程中.
2.3 对配子质量的影响
暴露组卵细胞的大小与对照组相比无显著性差异(1-way ANOVA,P>0.05).结果表明,粘油砾石暴露对卵细胞的尺寸无显著效应,说明卵细胞的大小不适合作为监测短期粘油砾石暴露对成年海胆繁殖状态影响的指标.已有研究发现海胆种群密度大的区域雌海胆所排卵细胞较小,而种群密度小的区域雌海胆所排卵细胞较大,说明卵细胞的大小具有可塑性[43].Sch?fer 等[44]的研究发现菲的浓度为500μg/L暴露20d,抑制海胆性腺内未成熟卵细胞的生长.据此推断本研究中卵细胞尺寸未发生变化可能是因为暴露时间较短,雌海胆未能及时调整卵细胞大小.
亲代海胆暴露在粘油砾石柱流出液中 7d 对受精率并无显著影响(2-way ANOVA,P>0.05),最大受精率为 800μg/g 组的双本暴露受精卵((99.23± 0.69)%).结果表明,雄海胆短期暴露于粘油砾石流出液中并未影响精子的受精能力,与其他学者的研究结果一致[28,46].
2.4 对子代海胆胚胎早期发育的影响
将各组子代继续暴露在相同浓度的流出液中培养 48h,并在胚胎受精后 24h 原肠期(图 3)和 48h 长腕幼虫期(图 4)观测子代畸形率,并计算综合毒性指数(ITI,表 3).生长在 FSW 中的对照组双亲子代畸形率始终低于 10%.
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