关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞不同共培养方式对细胞增殖与分化的影响

发布时间：2019-10-29所属分类：医学论文浏览：1152次

摘 要： 摘要 背景：在关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养环境中，软骨细胞功能活跃，增殖速度加快，骨髓间充质干细胞促进了软骨细胞的表型维持，而且少量软骨细胞提供的微环境能够诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化，降低了软骨分化过程中出现的肥大表型和软骨内骨

　　摘要

　　背景：在关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养环境中，软骨细胞功能活跃，增殖速度加快，骨髓间充质干细胞促进了软骨细胞的表型维持，而且少量软骨细胞提供的微环境能够诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化，降低了软骨分化过程中出现的肥大表型和软骨内骨化，但是影响共培养系统中细胞增殖分化的因素和细胞间相互作用的机制尚不明确。目的：观察软骨细胞和骨髓间充质干细胞接触共培养对细胞增殖分化的影响，进一步优化共培养方式，为探讨共培养系统中二者的相互作用机制提供依据。方法：分离和培养新西兰兔(南京医科大学实验动物中心提供)软骨细胞和骨髓间充质干细胞，取第 2 代软骨细胞和骨髓间充质干细胞，以 1∶3 的比例直接混合在 24 孔板进行接触共培养为接触共培养组，以 1∶3 比例分别在 Transwell 的上室和下室进行非接触共培养为非接触共培养组，共培养 21 d。细胞爬片进行甲苯胺蓝染色、COL2a1 及 Cx43 细胞免疫化学染色。应用 CCK8 检测共培养系统中细胞的增殖情况，ELISA 检测共培养细胞上清液中糖胺聚糖和转化生长因子 β3 水平，Western blot 检测共培养细胞 COL2a1 和 Cx43 的表达。然后添加转化生长因子 β3 进行软骨细胞和骨髓间充质干细胞接触共培养和非接触共培养，比较细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 蛋白表达的变化。结果与结论：①随着共培养时间的延长，细胞增殖能力逐渐增高，接触共培养组细胞吸光度值明显高于非接触共培养组(P < 0.05)，糖胺聚糖和转化生长因子 β3 水平以及 COL2a1 和 Cx43 的蛋白表达明显高于非接触共培养组;②添加 10 µg/L 转化生长因子 β3 共培养 21 d，接触共培养组细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 的表达与未添加转化生长因子 β3 比较无明显变化(P > 0.05)，而非接触共培养组的细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 蛋白表达明显提高(P < 0.05)，但仍明显低于未添加转化生长因子 β3 的接触共培养组(P < 0.05);③结果表明，接触共培养比非接触共培养明显促进细胞的增殖和分化，Cx43 在其中起重要作用。

　　关键词：关节软骨细胞;骨髓间充质干细胞;共培养;增殖;分化;糖胺聚糖;Ⅱ型胶原;转化生长因子 β3;缝隙连接;连接蛋白;干细胞

　　0 引言 Introduction

　　由于关节软骨无血管、神经组织，其自身缺乏有效的修复能力，组织工程技术为解决这一难题提供了新思路，安全可靠的种子细胞源是构建组织工程化软骨的前提。自体关节软骨细胞(articular chondrocytes，ACs)作为种子细胞，其在体外培养增殖能力低，连续传代后发生去分化丧失表达Ⅱ型胶原的能力，从而失去原有的表型，并且获取软骨细胞的来源受限，存在供区并发症;而骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为种子细胞则需要多种生长因子的诱导，分化过程中产生典型的肥大表型和骨化标志碱性磷酸酶及Ⅹ型胶原而发生软骨内骨化[1-3]。因此，ACs和BMSCs均不能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，而将两种细胞进行共培养就成为可供选择的方式[1-6]。大量的研究和作者前期实验发现 ACs和BMSCs接触共培养能够促进ACs的增殖和表型维持，而且少量ACs为BMSCs提供了软骨分化的微环境，因此，ACs和BMSCs共培养为解决ACs来源不足提供了切实可行的途径[3-6]，但是影响共培养系统中细胞增殖和分化的因素及调节细胞之间作用的机制尚不明确，为此，该研究观察ACs和BMSCs接触共培养对细胞增殖和分化的影响，进一步优化共培养方式，为构建工程化软骨提供新的策略。

　　1 材料和方法 Materials and methods

　　1.1 设计 细胞学及分子生物学随机对比实验。

　　1.2 时间及地点 于2017年1至12月在徐州医科大学附属连云港市东方医院临床研究中心实验室完成。

　　1.3 材料

　　1.3.1 实验动物 健康2月龄新西兰兔12只，雌雄不限，体质量0.8-1.2 kg，由南京医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：201500099。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

　　1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM培养基(Gibco公司，美国);青/链霉素(碧云天生物技术研究所，上海);胎牛血清 (Hyclone公司，美国);转化生长因子β3(Peprotech公司，美国);甲苯胺蓝染液(Sigma公司，美国);Transwell培养系统(Corning公司，美国);CCK8试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海);Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，美国);GAG定量分析酶联吸附分析试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司 USCN，武汉);转化生长因子β3免疫试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司USCN，武汉);Ⅱ型胶原(type II collagen， COL2)单克隆抗体(Novus，美国);连接蛋白43(connexin 43，Cx43)单克隆抗体(Abcam公司，美国);GAPDH单克隆抗体(Abcam公司，美国);HRP标记的山羊抗兔二抗(中杉金桥，北京);DAB显色剂(碧云天生物技术研究所，上海);相差显微镜(Olympus显微镜，日本);CO2恒温孵育箱 (Thermo公司，美国);酶标仪(Molecular Devices公司，美国);Tanon-5200化学发光仪(天能公司，上海)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 BMSCs和ACs的分离培养和共培养 应用作者所在实验室提供的方法进行BMSCs和ACs分离培养[3，6]。

　　在局麻下用骨穿针于新西兰兔胫骨和股骨骨髓腔抽取骨髓并且肝素化，应用密度梯度离心和贴壁培养法分离出 BMSCs，在体积分数5%CO2孵育箱中37 ℃饱和湿度条件下用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。

　　无菌条件下切取新西兰兔膝关节软骨，PBS漂洗后用眼科剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，应用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶进行消化，200目滤网过滤后离心，用PBS漂洗再次离心后在同一条件下进行ACs培养。

　　实验取第2代ACs和第2代BMSCs以1∶3的比例进行接触共培养和非接触共培养，细胞总数为4×104 。

　　1.4.2 ACs和BMSCs接触共培养和非接触共培养 取第2 代ACs和第2代BMSCs，按1∶3的比例在上述同一条件下直接混合进行接触共培养为接触共培养组，按1﹕3的比例在Transwell的上室和下室进行非接触共培养为非接触共培养组。孔板底部和Transwell的下室均放置盖玻片进行细胞爬片。每3 d更换1次培养基，共培养21 d。

　　1.4.3 添加转化生长因子β3进行BMSCs和ACs接触共培养和非接触共培养 向接触共培养组和非接触共培养组分别加入10 µg/L的转化生长因子β3进行共培养21 d。

　　1.5 主要观察指标

　　1.5.1 共培养后细胞形态学变化以及免疫化学染色检测共培养细胞COL2a1和Cx43的表达 共培养21 d，取出细胞爬片，PBS冲洗后应用预冷的40 g/L多聚甲醛固定 10 min，加入甲苯胺蓝进行细胞染色，相差显微镜下观察细胞形态和蛋白多糖的合成。分别应用COL2a1和Cx43的鼠抗兔单克隆抗体进行细胞免疫化学染色评价共培养细胞 COL2a1和Cx43的表达。

　　1.5.2 CCK8试剂盒检测共培养细胞的增殖情况 取共培养细胞悬液100 μL接种至96孔板，每孔加入10 μL的CCK8 (n=6)，在培养箱中共孵育2 h，根据操作说明，应用酶标仪测定波长为450 nm处的吸光度值，根据吸光度值绘制共培养细胞的生长曲线。

　　1.5.3 ELISA法测定共培养系统中糖胺多糖和转化生长因子β3水平 收集共培养细胞的上清液，按照酶联免疫试剂盒操作说明检测共培养细胞上清液中糖胺多糖和转化生长因子β3水平。

　　1.5.4 Western blot检测共培养细胞COL2a1和Cx43的表达 共培养21 d，加入预冷的RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃ 下12 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液。应用BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，加入5×RSB，煮沸5 min， -20 ℃保存。每个泳道加20-40 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，分别与COL2a1和 Cx43的单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗结合，检测上述蛋白的表达水平。应用Image J图像分析系统，根据蛋白条带灰度分析共培养细胞COL2a1和Cx43表达的差异。

　　1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料用x _ ±s表示，符合正态分布的两组均数比较采用独立样本t 检验;多组比较采用单因素方差分析，各组之间两两比较采用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

　　2 结果 Results

　　2.1 共培养细胞的形态变化 分离培养的第2代BMSCs 呈纺锤形或长梭形，细胞折光性强，与成纤维细胞形态相似，排列具有方向性，呈漩涡样或辐射状，见图1A。第2 代ACs呈多角形、三角形或不规则的卵圆形，核为圆形或椭圆形，可见成簇生长现象，细胞核居细胞中心，胞浆丰富，细胞增殖融合为单层，呈多边形或星形，排列紧密为 “铺路石”样，见图1B。

　　接触共培养组共培养4 h细胞开始贴壁，随着ACs和 BMSCs共培养时间的延长，长梭形细胞逐渐变为多角形、类圆形，呈聚集生长，形态接近软骨细胞。接触共培养21 d，甲苯胺蓝染色显示共培养细胞及其周围基质浓染，细胞核质分界清晰，细胞核被染成深蓝色，胞质染成蓝紫色，见图2A。细胞免疫化学COL2a1染色后胞浆染成棕黄色，胞核不着色，为强阳性，见图2B。

　　非接触共培养组共培养21 d，观察Transwell下室的 BMSCs，发现仅有部分细胞变为多角形或类圆形，大部分细胞仍呈长梭形或短梭形，甲苯胺蓝染色显示共培养细胞及其周围基质染色较浅，COL2a1染色为弱阳性，而ACs 体积和核浆比例变化不大，见图3。 2.2 ACs和BMSCs接触共培养对细胞增殖分化的影响随着ACs和BMSCs共培养时间的延长，共培养细胞平均吸光度值逐渐增高，共培养21 d接触共培养组细胞吸光度值明显高于非接触共培养组(P < 0.05)，见图4。培养上清液中糖胺多糖和转化生长因子β3水平，见表1。共培养细胞COL2a1和Cx43的表达明显高于非接触共培养组(P < 0.05)，见图5。

　　2.3 外源性转化生长因子β3对共培养细胞增殖分化的影响 接触共培养组和非接触共培养组添加10 µg/L转化生长因子β3进行共培养21 d，接触共培养组添加转化生长因子β3前后细胞增殖无明显变化(P > 0.05)，见图4，培养上清液中糖胺多糖水平和共培养细胞COL2a1及Cx43的表达增高也无显著性意义(P > 0.05);而非接触共培养组添加转化生长因子β3后细胞的增殖、培养上清液糖胺多糖水平和共培养细胞COL2a1及Cx43的表达则明显提高(P < 0.05)，但仍明显低于接触共培养组(P < 0.05)，见表1，图5和图6。

　　3 讨论 Discussion

　　关节软骨主要由透明软骨细胞和细胞外基质(以Ⅱ型胶原和多聚蛋白多糖为主)构成，无血管和神经支配，损伤缺损后难以自我修复[1-6]。组织工程学技术为解决这一难题提供了新方法，安全可靠的种子细胞源是构建组织工程化软骨的前提。ACs和BMSCs都可能用于构建组织工程化软骨，但是软骨细胞获取受限，并且体外培养增殖能力低，在连续传代后发生去分化丧失表达Ⅱ型胶原的能力，其表型难于维持，产生的细胞外基质以Ⅰ型胶原为主，其机械强度、弹性模量等力学性能较Ⅱ型胶原明显降低;而 BMSCs作为种子细胞则需要多种生长因子的诱导，分化过程中产生典型的肥大表型和骨化标志Ⅹ型胶原及碱性磷酸酶而发生软骨内骨化。因此，ACs和BMSCs均不能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求[1-6]。大量研究表明 BMSCs和ACs共培养能够促进ACs的增殖和表型维持，而且少量ACs为BMSCs的软骨分化提供了微环境，减少了 ACs的需要量，并且共培养可降低分化过程中出现的钙化和肥大表型[3-6]，但是影响共培养系统中细胞增殖分化的因素和调节机制尚不明确，因此研究ACs和BMSCs接触共培养方式对细胞增殖和分化的影响，可以优化共培养方式，对进一步探讨共培养系统中BMSCs和ACs相互作用机制奠定基础，为临床应用组织工程学技术修复关节软骨缺损提供理论支撑。

　　共培养系统中最佳的细胞比例是构建高质量组织工程化软骨的关键因素。不同共培养条件下两种细胞的最佳共培养比例尚未确定[7]。Kang等[8]研究表明ACs和BMSCs共培养中ACs的比例达到20%以上时，与同等数量单纯ACs 构建的软骨较为接近，当ACs达到一定数量时，增加ACs 的比例，BMSCs的诱导结果不发生改变，提示ACs对 BMSCs的诱导作用存在饱和现象，并且降低BMSCs在共培养系统中的比例，也会减少BMSCs对ACs的营养支持作用[9-10]。Meretoja等[11]研究表明1∶3的细胞比例既能维持 ACs的表型以及为BMSCs软骨分化提供微环境，又能明显减少ACs的用量，与Yao等[12]的研究结果一致。因此，该实验以1∶3比例的ACs和BMSCs进行共培养实验。

　　细胞接触共培养和经Transwell非接触共培养是不同的两种共培养方式，Transwell培养瓶的隔离膜孔径0.4 µm，仅能允许可溶性分子通过，而BMSCs和ACs不能自由通过，这就消除了细胞之间相互接触的影响。实验应用接触和非接触两种共培养方式对BMSCs与ACs增殖、分化的影响进行了比较研究，结果表明：接触共培养系统中糖胺多糖和转化生长因子β3水平及COL2a1的表达均高于非接触共培养，并且接触共培养系统中ACs体积增大，核浆比例提高，提示ACs功能活跃，增殖速度快，甲苯胺蓝染色及细胞免疫染色显示有大量的软骨陷窝形成和COL2a1的合成，说明接触共培养明显促进ACs的增殖和表型的维持， ACs的微环境诱导了BMSCs的软骨分化。Cx43存在于多种类型的细胞中，正常软骨组织和BMSCs均表达Cx43[13-15]， De Windt等[16]应用BMSCs和ACs进行共培养研究，结果表明BMSCs和ACs之间通过Cx43使两种细胞建立了缝隙连接通道。此次研究检测了共培养细胞的Cx43表达，结果表明接触共培养细胞Cx43及COL2a1的表达明显高于非接触共培养细胞，说明Cx43参与了共培养细胞增殖和分化的调节[16]。

　　ACs和BMSCs共培养促进细胞增殖和分化的机制是活性因子的营养作用还是直接接触的作用还存在争议[10，16-17]。为消除两种共培养系统中内生性转化生长因子对细胞增殖和分化的影响，该实验向ACs和BMSCs共培养系统中添加转化生长因子β3进行比较研究，结果表明：接触共培养细胞的增殖、糖胺多糖水平、COL2a1及Cx43的表达无明显变化，说明接触共培养细胞具有明显的成软骨活性和增殖能力，也侧面证实了ACs和BMSCs接触共培养不需要诱导因子的刺激。Dahlin等[18]在ACs和BMSCs共培养系统中应用不同质量浓度的转化生长因子β3进行诱导共培养，结果表明应用1 μg/L或10 μg/L转化生长因子β3共培养，共培养细胞产生同样的糖胺多糖，与ACs或BMSCs单层培养比较，共培养有效降低了转化生长因子β3的用量和时间，达到了同样的软骨分化水平;去除转化生长因子β3 刺激后，共培养细胞的软骨分化表型更稳定。因此，共培养系统的微环境提高了共培养细胞对生长因子反应的敏感性[19-20]。该研究添加转化生长因子β3进行非接触共培养，共培养细胞的增殖、糖胺多糖水平、COL2a1及Cx43的表达增强，但仍明显低于未添加转化生长因子β3的接触共培养，说明细胞间直接接触比转化生长因子促进共培养细胞增殖和分化的作用更为重要，Cx43的表达水平影响了细胞的增殖和分化，与Zuo等[7]和De Windt等[16]的研究结果类似。Schrobback等[21]在人BMSCs和ACs共培养系统中添加 Cx43阻断剂甘草次酸进行共培养，分析共培养细胞的软骨分化潜能，结果表明BMSCs和ACs共培养期间经甘草次酸阻断后，COL2和细胞外ATP减少及软骨分化潜能下降，进一步证实了Cx43的表达水平决定了共培养细胞的增殖和分化。因此，应用外源性Cx43或其类似物可能为构建工程化软骨提供新的策略[22-23]，但是具体的机制和详细的信号传导通路尚不清楚，需要进一步研究。

　　综上所述，ACs和BMSCs接触共培养能够明显促进细胞的增殖和分化，细胞间缝隙连接参与了共培养细胞增殖分化的调节，Cx43起到了重要作用。

　　相关期刊推荐：《中国组织工程研究》杂于1997年创办，发表组织工程研究中关于干细胞培养与移植、组织构建、材料生物相容性评价(天然或合成材料与纳米粒子、人工材料植入体、植入器官及外源性细胞)、计算机辅助骨外科技术的应用基础及临床研究，转化医学和循证医学研究的文章，发表中国组织工程研究领域一流水平的学术、技术创新成果。有投稿需求的作者，可以直接与期刊天空在线编辑联系。

婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繐霉閸忓吋缍戦柛銊ュ€块弻锝夋偄瀹勬壆鐩庨梺鍏兼緲濞尖€愁嚕閸洖閱囨繛鎴灻‖澶娾攽閻愬弶鍣藉┑顔肩仛缁岃鲸绻濋崶顬囨煕鐏炲墽鐓瑙勬礋濮婃椽宕ㄦ繝搴㈢杹婵炲瓨绮岄悥鐓庮嚕婵犳艾惟闁冲搫鍊告禍鐐烘⒑缁嬫寧婀扮紒瀣灴椤㈡棃鏁撻敓锟�:闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕閻庤娲﹂崹鍫曠嵁閹邦厽鍎熼柕蹇ョ磿瑜板潡姊洪悷鏉挎倯闁伙綆浜畷鐟懊洪鍕厬闂婎偄娲︾粙鎺楁偂閻斿吋鐓忛煫鍥э攻閸ゅ鎲搁悧鍫濈瑨缂佲偓閸曨垱鐓熸俊顖濆亹鐢盯鏌ｉ幘瀛樼闁哄瞼鍠愮€佃偐鈧稒蓱闁款參姊洪崫鍕靛剳闁哥姵鐗犲璇测槈濮橈絽浜鹃柨婵嗛娴滅偛顭胯閸撶喖寮婚弴銏犵倞鐟滃秹顢旈鐘亾濞堝灝娅橀柛锝忕到閻ｇ兘宕奸弴妞诲亾閺嶎収鏁婇柤鎭掑劚绾惧啿鈹戦纭峰伐妞ゎ厼鍢查悾鐑芥偄绾拌鲸鏅濋梺闈涙处婵℃悂宕堕妸褍骞愰梺璇茬箳閸嬬娀顢氳閸┾偓妞ゆ帊鑳舵晶杈╃磽閸屾稒宕岄柟宕囧仱婵＄兘濡疯閻涱喖鈹戦悩顔肩伇婵炲鐩鐢割敆閸曨偆鏌ф繝闈涘€搁幉锟犲煕閹烘嚚褰掓晲閸噥浠╅柣銏╁灡閻╊垶寮婚悢鍝勬瀳闁告鍋樼花钘夆攽閳ュ啿绾ч柛鏃€鐟ラ锝夊箻椤旇棄浜归梺褰掝暒閻掞妇绱炲Δ鍛拻濞达絽鎲￠幆鍫ユ煕閻曚礁浜伴柟顔ㄥ洤骞㈡繛鍡樺灣缁楀姊洪幐搴ｇ畵婵☆偅绋撶划缁樸偅閸愨晝鍘遍梺鏂ユ櫅閸犳艾鈻撳▎鎾村€垫慨姗嗗幗缁舵煡妫佹径瀣瘈濠电姴鍊搁鈺呮煕閺傝鈧繂螞娴ｇ懓绶為柟閭﹀幘閸欏棗鈹戦悩缁樻锭婵☆偅鐟╅獮鏍箛閻楀牏鍘遍梺鍝勫€归娆撳磿閹邦儮搴ㄥ炊瑜濋煬顒併亜閵忥紕鈽夋い顐ｇ箞楠炴垿骞囬浣稿壍闂傚倸鍊风粈渚€骞栭锔藉剹濠㈣泛鏈畷鍙夌節闂堟稒顥犻柡鍡檮閵囧嫯绠涢幘鏉戞婵犳鍨遍幐鎶藉蓟濞戞ǚ妲堟慨妤€鐗嗘慨娑欑箾鐎涙ḿ鐭嬮柣妤冨Т椤繒绱掑Ο鑲╂嚌闂侀€炲苯澧撮柛鈹惧亾濡炪倖甯掗崐鍛婄濠婂牊鐓犳繛鑼额嚙閻忥妇鈧娲忛崹钘夌暦閵婏妇绡€濞达綀娅ｉ悾楣冩⒒娴ｈ櫣甯涢柛鏃€鐗曞玻鍨枎閹寸姷鐣堕悷婊冪箳濡叉劙骞掑Δ濠冩櫓闁荤喐鐟ョ€氼參鎮甸弴銏♀拺闂傚牊绋撴晶宕囩磽瀹ュ嫮顦﹂柣锝呭槻椤粓鍩€椤掍椒绻嗛柟闂寸劍閺呮粎绱撴担鐧镐緵婵☆偁鍔戝濠氬磼濮橆兘鍋撴搴㈩偨婵﹩鍏楃紓姘舵煠婵劕鈧劙宕戦幘缁橆棃婵炴垶姘ㄩ崝顖炴倵鐟欏嫭纾搁柛銊︽そ婵″爼鏁愭径濠勵槰闂侀潧臎鐏炶姤娅嶉梻鍌氬€烽懗鑸电仚缂備胶绮敋閾荤偤鎮归幁鎺戝鐎规洘鐓￠弻娑㈠焺閸忥附绮嶇粋宥呪堪閸喓鍘甸梻渚囧弿缁犳垿寮稿☉銏＄厸閻庯綆浜妤呮婢跺绡€濠电姴鍊搁弳娆撴煃闁垮鈷掔紒杈ㄥ笚濞煎繘濡搁敃鈧棄宥夋⒑閻熸澘妲婚柟鍐茬箻钘濋柣妤€鐗婇崕鐔镐繆椤栨粎甯涙繛鍛暣濮婂宕掑▎鎴濆闂佽鍠栭悥鐓庣暦濠靛棭鍚嬮柛婊€鐒︾€靛矂姊洪懞銉冾亪藝娴犲鍚归柡鍥ュ灪閻撴瑩鏌熼娑欑凡鐞氭岸姊虹粙娆惧剰閻庢矮鍗冲濠氭晲婢跺﹦顔掗梺鎯ф禋閸嬪懎鐣烽崘宸富闁靛牆妫欓悡銉︺亜閿旇鐏﹂柍銉︽瀹曟﹢顢欓崲澹洦鐓曢柍鈺佸枦娓氭稒鎱ㄦ繝鍌涘仴婵﹨娅ｇ划娆忊枎閹冨闂備礁鎲″鐟懊洪悢鍏兼櫜闁绘劖绁撮弨浠嬫倵閿濆簶鍋撻娑欐珚闁哄苯绉瑰畷顐﹀礋椤愮喎浜惧┑鐘宠壘閻鏌涢埄鍐︿粶闁衡偓娴犲鐓熼柟閭﹀幗缂嶆垿鏌ｈ箛銉х暠闁伙絾绻堥弫鎰板川椤旈棿娣梻浣筋嚃閸犳岸宕戦妶澶婅摕闁靛ě鈧崑鎾绘晲閸愩劌顬嗙紓浣靛妼椤嘲顫忓ú顏勪紶闁告洦鍓欓ˇ鈺侇渻閵堝啫濡兼俊顐ｎ殜閸┿垹顓奸崱娆戠槇闂佸憡娲忛崝灞剧閻愵剛绠鹃柛顐ｇ箘娴犮垽鏌＄€ｃ劌鈧洟鈥﹂懗顖ｆЪ濡炪們鍔岄敃顏堟偘椤曗偓瀹曞崬鈽夊Ο鑲╂綁闂備礁澹婇崑鍛崲瀹ュ懇缂氬┑鐘叉处閳锋垿鏌￠崒妯哄姕婵炲懎鎳橀弻娑㈡偆娴ｉ晲鍠婂銈冨灪濮婂湱鈧絻鍋愰埀顒佺⊕鑿ら柟椋庣帛缁绘稒娼忛崜褍鍩岄梺纭咁嚋缁绘繈鐛崱娑橀唶闁靛濡囬崢杈ㄧ節閻㈤潧孝濠殿垶浜跺畷鐑筋敇閻愯尙鏌ч梻鍌氬€风欢姘缚瑜戦崳褰掓⒑缁嬫寧婀扮紒顔兼湰閺呰埖銈ｉ崘鈹炬嫽婵炶揪缍€濞咃絿鏁☉銏＄厱闁哄啠鍋撴繛鍙夌墳閻忔帗绻濋悽闈浶㈡繛灞傚€濋幃鍧楊敋閳ь剟寮诲☉妯锋婵☆垰鍚嬮幉濂告⒑缂佹ɑ灏靛┑顔惧厴閹偓妞ゅ繐鐗嗙痪褔鏌涢…鎴濇灕闁糕晝鍋炵换婵嬪煕閳ь剟宕掑顒傘偖闂備礁鎼惌澶岀礊娴ｉ€涚箚闁绘垼妫勫敮闂佹寧娲嶉崑鎾寸箾閸噥娈滄慨濠冩そ瀹曨偊宕熼浣瑰缂傚倷绀侀鍡涘垂閸ф鏄ラ柕蹇婂墲閸庣喖鏌曟繛鍨姢闁汇倐鍋撳┑锛勫亼閸婃牜鏁幒妤€纾瑰瀣椤洘鎱ㄥ璇蹭壕濠殿喖锕︾划顖滅箔閻旂厧鐒垫い鎺嗗亾瀹€锝堝劵椤︽煡鎽堕悙缈犵箚闁靛牆鎳忛崳褰掓煟閵堝骸鏋涢棁澶愭煕韫囨挸鎮戠紓宥嗗灩缁辨帡鎮╅棃娑欑亪闂佽鍠楅〃鍛村煡婢跺ň鏋嶉柧蹇ｅ亜閻忥箓鏌涢幒鎴姛闁逞屽墴濞佳囧箺濠婂懎顥氬┑鍌氭啞閸婄敻鏌ㄥ┑鍡涱€楁鐐搭殘閻ヮ亪顢橀埄鍐€愰梻鍥ь槹缁绘繃绻濋崒姘间紑婵犫拃鍐粵闁逛究鍔嶇换婵嬪礃閳瑰じ铏庢俊銈囧Х閸嬬偤宕濋弽顓炵畾闁哄啫鐗婇弲鏌ユ煕鐏炲彞绶辨繛鍏兼濮婂宕掑▎鎴М闂佸湱鈷堥崑濠囧箖瑜嶉オ浼村醇濠靛牜妲舵繝娈垮枟钃卞褍閰ｅ畷鎴﹀箻缂佹﹩妫冨┑鐐村灦閻楁洘绂掗鈧幃妤冩喆閸曨剛顦ㄩ梺鎸庢磸閸ㄤ粙濡存担绯曟瀻闁圭偓娼欏▓鎰版⒑閸愬弶鎯堥柛鐕佸亰閹瑦绻濋崒妤佹杸闂佺粯锚閻忔岸寮抽埡浣叉斀妞ゆ梻铏庡Λ搴☆熆瑜庣换鍫濐潖閾忓湱鐭欐繛鍡樺劤閸撻亶姊洪崷顓€瑙勬櫠閽樺）锝夊箛閺夎法顔掗梺褰掝暒缁€渚€骞冮幋锔解拺缂侇垱娲栨晶鏌ユ煥閺囨娅呴摶鐐烘煕閹伴潧鏋熼柍閿嬪灩閻ヮ亪顢橀悙鏉戞闂佺粯绻嶆禍顏堝蓟閻斿吋鍋￠柣妤€鐗嗛弸鐘绘倵濞堝灝娅橀柛瀣躬閻涱喖螣閼测晝锛滃┑鈽嗗灣缁垶顢旈悢鍏尖拻濞达綀濮ょ涵鍫曟煕閿濆繒鐣垫鐐茬箻閺佹捇鏁撻敓锟�.闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕閻庤娲﹂崹璺虹暦缁嬭鏃€鎷呯化鏇炰壕闁割偅娲橀悡鏇熴亜閹邦喖孝闁告梹宀搁弻锝夊箳閹寸姳绮甸梺闈涙搐鐎氫即鐛幒鎴悑闁搞儴鍩栬ⅵ婵犵數濮幏鍐沪閻ｅ奔鐢荤紓鍌欒兌缁垳绮欓幘瀵割浄闁挎洖鍊哥壕鍏兼叏濮楀牏鍒板ù婊呭亾缁绘繈妫冨☉鍗炲壈闂佽棄鍟伴崰鏍蓟閵娿儮妲堟俊顖欒娴犻亶姊虹粙娆惧剱闁圭懓娲顐﹀箛椤撶喎鍔呴梺鐐藉劥鐏忔瑩寮弽顓熲拻濞达綀顫夐妵鐔兼煕濡亽鍋㈡い銏＄墬瀵板嫰骞囬鍐╂啺婵犵數鍋為崹鍫曞春閸愵喖纾婚柟鍓х帛閺呮煡骞栫€涙ḿ绠橀柡浣圭墵閺屸剝鎷呴崫銉モ叺闂佽鍠楅〃鍛村煝閹捐鍨傛い鏃傛櫕娴滅偤姊绘担鍛婂暈妞ゃ劌妫欑换娑欑節閸ヮ灛銉ッ归敐鍥┿€婃俊鎻掔墛娣囧﹪顢涢悙瀛樻殸闂佽楠搁…宄邦潖濞差亝鍋￠梺顓ㄧ畱濞堣埖绻濆▓鍨珮闁告瑥鍟锝囩矙鎼存挻鐎婚梺鐟板⒔鐞涖儵骞忕紒妯肩閺夊牆澧介幃濂稿几椤忓牊鐓欐い鏃囨閻忥妇绱掔紒妯肩疄濠殿喒鍋撻梺瀹犳閹虫捇鍩€椤掍礁顕滄い銊ｅ劦閹瑧鎷犺娴兼劕顪冮妶鍡樺碍闁靛牏枪閻ｇ兘宕奸弴鐐靛幐闂佸憡鍔︽禍婵嗏枔娴犲鈷掗柛灞剧懅椤︼箓鏌熺喊鍗炰簽缂侇喗妫冨濠氬Ψ閵壯屾Х闂佺懓鍚嬮悾顏堝礉瀹€鍕亗婵犻潧顑嗛悡娑㈡煕閹扳晛濡奸柍褜鍓涢弫璇茬暦閹达箑绠婚柤濮愬€曠粊锕傛⒑閸撹尙鍘涢柛鐘崇墬閹便劍鎯旈埦鈧弨浠嬫煃閽樺顥滃ù婊勭箖閵囧嫰濡搁妷顖氫紣闂佷紮绲块崗妯绘叏閳ь剟鏌曢崼婵囧櫧妞ゆ柨锕ら埞鎴炲箠闁稿﹥鎹囬幊妤呭醇閺囩偛鍋嶉梺褰掓？閻掞箓鍩涢幋锔界厱闁圭偓娼欑徊璇裁瑰⿰鈧划娆撳蓟濞戞埃鍋撻敐搴濈盎妞ゅ浚浜弻锟犲川椤撶姴鐓熷銈冨灪瀹€鎼佸春閳ь剚銇勯幒鍡椾壕濡炪値鍋勭换姗€骞栭崷顓熷枂闁告洦鍋呴悗顓㈡⒒娴ｇ懓顕滅紒璇插€歌灋婵炲棙鎸婚崑鐔告叏濡灝鐓愰柛濠勬暬閹嘲鈻庤箛鎿冧痪缂備礁鐭佸▔鏇犳閹炬剚鍚嬮柛鏇ㄥ弾濡差喖顪冮妶鍡樼┛缂傚秳绀侀悾宄扳堪閸曨剙顎撻梺鑽ゅ枑婢瑰棝鏁嶈箛娑欌拻濞撴埃鍋撴繛浣冲洢鍋戦柛顭戝亗缁诲棝鏌涢妷銏℃珖闁活厽鎹囬弻娑㈠箻濡も偓閹虫劙鏁嶅┑瀣拺缂佸瀵у﹢浼存煟閻旀潙濮傛い銏＄懄瀵板嫰骞囬鐘插箞闂佽鍑界紞鍡涘磻閸涱厾鏆︾€光偓閸曨剛鍘搁悗鍏夊亾閻庯綆鍓涜ⅵ婵°倗濮烽崑娑㈩敄婢舵劕绠栨繛鍡樻尭楠炪垺淇婇婵囶仩濞寸厧鐭傚铏规嫚閳ヨ櫕鐏嶅銈冨妼閿曨亪濡存担鍓叉僵閻犻缚娅ｉ崝锕€顪冮妶鍡楃瑨閻庢凹鍓熼幏鎴︽偄閸忚偐鍙嗗┑鐘绘涧濡瑦鍒婇崗鑲╃閻忓繑鐗楀▍濠囨煛瀹€瀣М妤犵偞锕㈠畷妯侯啅椤旂厧唯闂傚倷娴囬褏鎹㈤幇顑╂稑鈻庨幋鐐插簥濠电偞鍨崹娲疾閺屻儲鐓曟繛鎴濆船閺嬬喖鏌熼鐣屾噰婵﹥妞介獮鎰償閵忕媭妲卞┑鐐茬摠缁姵绂嶉鍫濈畺濞村吋鎯岄弫濠囨煟閿濆懐鐏遍柟铏箞濮婃椽鏌呴悙鑼跺濠⒀冾嚟閳ь剚顔栭崳顕€宕戞繝鍥╁祦婵☆垵鍋愮壕鍏间繆椤栨粎甯涙い蹇曞枛濮婄粯鎷呴懞銉с€婇梺闈╃秶缁犳捇鐛箛娑欐櫢闁跨噦鎷�,闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋涢ˇ鐢稿极閹剧粯鍋愰柛鎰紦閻㈢粯淇婇悙顏勨偓鏍偋濠婂牆纾绘繛鎴欏灩閸ㄥ倿鏌涘畝鈧崑鐐烘偂閺囩喆浜滄い鎾跺枎閻忋儱霉濠婂懎浠﹂柕鍥у閸╋繝宕橀妸銉ョ闂備礁鎼張顒勬儎椤栫偑鈧線寮撮姀鈥充汗闂佽偐鈷堥崗娑㈠箖閿濆鈷戦悹鍥ㄧ叀椤庢鏌ｈ箛鏂垮摵闁诡噯绻濋弫鎾绘偐閼艰埖鎲伴梻渚€娼ц墝闁哄懏绮撳畷鎴﹀幢濞戞瑧鍘遍柣蹇曞仜婢т粙鍩ユ径瀣ㄤ簻闊洢鍎茬€氾拷闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹瀹勬噴褰掑炊椤掑鏅悷婊冪箻閸┾偓妞ゆ帊鑳堕埢鎾绘煛閸涱垰孝闁伙絽鍢茶灒闁煎鍊楅惁鍫濃攽椤旀枻渚涢柛妯绘倐楠炴劙宕橀瑙ｆ嫼闂佸憡绋戦敃銉﹀緞閸曨垱鐓曢悗锝庡亝瀹曞矂鏌熼搹顐ｅ磳鐎规洜枪铻栧ù锝呮惈瀵即姊绘繝搴′簻婵炴潙瀚濠囨嚍閵壯屾锤闂佸搫绋侀悘鎰版偡閹靛啿鐗氶梺鍛婃处閸橀箖鎮￠埀顒勬⒑閸撗呭笡闁绘濞€瀵濡搁妷銏℃杸闂佺硶鍓濋敋婵炲拑缍佸娲传閸曨剦妫ら梺绋款儍閸婃繂顕ｆ繝姘╅柕澶堝灪椤秹姊洪幆褎绂嬮柛瀣椤㈡棃鏁撻敓锟�婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾剧粯绻涢幋娆忕仾闁稿鍊濋弻鏇熺箾瑜嶉崯顐︽倶婵犲洦鍊甸柛蹇擃槸娴滈箖姊洪崨濠冨闁告挻鐟︾粋宥夋焼瀹ュ棌鎷洪梺鍛婄☉閿曪絿娆㈤柆宥嗙厱闁绘ê鍟块崫娲煏閸℃鍤囩€殿喖顭锋俊鐑芥晜閹冪闂傚倷鑳剁划顖炲垂閸洘鏅濋柍杞拌閺嬫棃鏌￠崘銊モ偓鑽ゅ婵傚憡鐓冪憸婊堝礈閻旈鏆﹂柛妤冨亹濡插牊绻涢崱妯虹仴妤犵偞顨嗙换婵堝枈濡椿娼戦梺鎼炲妿閺佽鐣烽幋锕€绠涙い鏃囧Г濞堟澘鈹戦悙鏉戠仧闁搞劍妞介幃锟犳偄閸濄儳鐦堥梺鍓茬厛閸嬪懐浜告导瀛樺€垫慨妯煎亾鐎氾拷.