发布时间：2019-12-14所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要：在高中阶段的生物学习中，了解到21世纪是生物技术大发展时期，各种技术革新纷纷涌现，本人对这一专业产生了兴趣，因此于2018年7月暑假期间来到宁波酶赛生物工程有限公司学习相关知识。该公司擅长生物酶和菌种相关的专业催化技术，在制药工程、精细化工
摘要：在高中阶段的生物学习中，了解到21世纪是生物技术大发展时期，各种技术革新纷纷涌现，本人对这一专业产生了兴趣，因此于2018年7月暑假期间来到宁波酶赛生物工程有限公司学习相关知识。该公司擅长生物酶和菌种相关的专业催化技术，在制药工程、精细化工、新型材料、生物产业、节能环保产业等领域提供技术支持。由于时间有限，在学习过程中，我着重了解并参与了构建定点突变单克隆的过程研究。
关键词：生物学习;定点突变单克隆
一、研究背景
单克隆技术当下是国内外的热点研究课题，但国内对于单克隆技术的研究仍存在一些问题，对单克隆领域的关键技术研究是远远不够的，还有待进一步提高。单克隆与克隆技术是两个不同的研究方向，区别在于克隆的定义更为广泛，克隆原意以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，随后范围扩展至以无性繁殖的方式培育动物：众所周知的典型代表为1996年的多利羊。虽然克隆有巨大的理论意义和实用价值，但它是一把双刃剑，有优点的同时也存在危险，它可能触及人类伦理道德方面的底线，因此各国也出台相关法律。而单克隆是指单一序列的质粒在平板上长出的菌落，只是利用克隆的理论和原理，培育的对象是不同的，单克隆主要针对质粒(如大肠杆菌等自身携带质粒)，安全性因此更高，同样不会有悖于人类伦理道德。
因此，设计这个课题目的旨在了解构建定点突变单克隆的基本过程，对于并非定点的突变单克隆还并未尝试。
二、理论及技术支持
以《分子生物学》和《细胞生物学》理论为基础，生物信息学技术和PCR技术为指导进行实验研究。
三、研究过程
(一)研究目的
在完成单克隆制备的流程时，先运用生物信息学技术和PCR技术，使用计算机设计含有定点突变位点的引物在模板载体上进行PCR扩增，再与标准DNAmarker表对比，判断其是否是假阳性，最终完成检测筛选过程。
(二)准备条件
1.实验器材(具备条件)：
12头移液枪(2～20μl)，PCR仪，恒温水浴锅，掌上离心机，涡旋仪，2ml离心管，离心管架，刀片，凝胶，计算机，平板，紫外凝胶显色仪，marker表
2.准备工作
①带实验手套
②载体的制备：选用合适的质粒，选择同一种限制性核酸内切酶打开环状结构，便于后续过程中与连接产物连接。
③设计引物：引物最好选用DNA，因为RNA在外界容易降解，所以在体外用DNA易操作，引物长度一般在15个碱基左右，在引物中加标记基因，用计算机，输入模板，设计多个突变位点。
④引物的稀释：将其装入离心管中，用离心机将其稀释。注意要先离心后再开盖加水，因为DNA是干粉状态，运输过程中有可能粘附在管盖和管壁上，直接打开后可能会丢失部分。加水量为DNA合成报告单上的nmol数目*100。
期刊推荐：《生物技术通报》是由中华人民共和国新闻出版总署、正式批准公开发行的优秀期刊。主要报道国内外农、牧、林、渔及医学、轻化等领域中生物技术研究的新进展、新技术、新成果与发展趋势，内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程以及生物工程的应用、新的实验技术与方法等。有投稿需求的，可以咨询期刊天空在线编辑。
(三)实验步骤和过程
1.扩增带突变的小片段(用PCR)，并用一种混合型酶消化模板基因。
2.将小片段拼成大片段。
3.目的片段扩增(PCR)：扩增获得含有突变位点的基因。
4.酶切：切出粘性末端，便于后期和载体连接。使用的限制性核酸内切酶通常放置于冰箱中，因为其较脆弱，使用时才将其取出。限制性核酸内切酶具有特异性，切出目的基因和切开环状载体时应该选择同一种限制性核酸内切酶，使其产生相同的粘性末端以连接。
5.切胶回收：用刀片在紫外凝胶显色仪中操作。提纯酶切的基因。切完情况如图，用切胶回收试剂盒提取待用。在紫外灯下切胶回收时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，防止出现外源DNA的污染。
6.连接：使用DNA连接酶，将载体通过特定的内切酶切出与产物相同的粘性末端。
7.转化：转化到大肠杆菌中，利用热量，类似质壁分离原理，制造出一些微小的“孔”让DNA进入。
8.涂平板：检测筛选，原理如下：之前扩增DNA的时候就已经带有了标记基因如xx抗性基因或者某显色基因，放入xx基因的平板上，利用选择培养基的原理进行培养，观察其是否在平板上生长和显色。
9.电泳检测：用电泳仪。电压一般采用5V/cm，可以有适当的电压差。温度在4~30℃都可行，常在室温下进行。但电流过大时凝胶温度升高，溶液蒸发，会造成电泳异常。将移液枪量程调至4μl，用其吸取DNA和染色剂，将其打入水平电泳槽中的凝胶的一排孔中(12个孔)，盖上盖子，用紫外凝胶显色仪可以看见条带，用DNAmarker对照看bp(碱基数)是否正确。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率很高。应用凝胶电泳可以正确的测定DNA片段的分子大小。
四、研究结论和反思
(一)结论
通过以上一系列实验，本人正确构建定点单克隆突变，并保证突变出现的效率足够高，确认该实验可行性，通过参与实验确认其具有足够高的安全性和操作简便性。单克隆操作流程严谨科学，却有较高的简便性，它有较高的使用价值和发展前景。
(二)反思
在一系列操作流程中，我也遇到了一些问题，通过对失败经验的总结，进行以下反思：
1.在使用12头移液枪将DNA混合染色剂注入凝胶的一排孔中的过程中失败过几次，原因在于未用手扶正移液枪，导致移液枪尖端扎入凝胶中，无法将液体导入小孔中进行电泳操作。
2.实践中存在构建多个突变位点过程中，偶尔有几个没出现突变现象，原因在于模板基因依旧存在。
3.在转移液体时也出现过转移错离心管的问题，因此在操作过程中务必细心。
4.在进行引物的稀释这一实验准备步骤的过程中，第一次并未先进行离心操作后再开盖加水，导致部分粘附在管盖上的DNA干粉丢失。
5.涂平板时没有在完全无菌的环境下进行，导致菌落污染。
SCISSCIAHCI
