发布时间：2020-01-17所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要: 目的 经正交设计的雷公藤多糖提取纯化实验，选出最佳雷公藤多糖提取纯化的工艺。方法 雷公藤叶和根经粉碎后用无水乙醇润湿，封口过夜，挥干药材; 用石油醚 60 ～ 90℃ 回流提取 1h，重复实验 1 次，挥干药材; 用 95% 乙醇回流提取 1h，重复实验 2 次，
摘要: 目的 经正交设计的雷公藤多糖提取纯化实验，选出最佳雷公藤多糖提取纯化的工艺。方法 雷公藤叶和根经粉碎后用无水乙醇润湿，封口过夜，挥干药材; 用石油醚 60 ～ 90℃ 回流提取 1h，重复实验 1 次，挥干药材; 用 95% 乙醇回流提取 1h，重复实验 2 次，挥干药材; 用去离子水水煮 1h，重复实验 2 次，浓缩水提取液到与药材重量相等。浓缩水提取液经乙醇醇沉，抽滤得到沉淀物经过氧化氢脱色后，以不同水提取液与乙醇的比例、氯仿与正丁醇体积比、脱色液与 Sevage 试剂( 氯仿: 正丁醇) 体积比、脱蛋白时间、除蛋白次数进行 4 因素 3 水平正交实验。结果 雷公藤多糖提取纯化最佳工艺条件为水提取液与乙醇的比例为 80% ，氯仿与正丁醇为 4 ∶ 1，脱色液与 Sevage 试剂为 3∶ 1，次数为 2 次，雷公藤多糖的脱蛋白率为 78. 5% ，多糖损失率为 33. 3% 。结论 经正交实验选出最佳雷公藤多糖提取纯化的工艺条件科学合理、稳定可行，为纯化雷公藤多糖提供实验依据。
关键词: 雷公藤; 多糖; 提取纯化; 单因素实验; 正交实验
雷公藤为卫矛科雷公藤属植物，又名黄藤根、菜虫药等[1]，味苦、辛，性凉。通过研究发现其药理作用有免疫调节、抗炎及抗肿瘤等作用[2]。对雷公藤深入研究，其临床应用也取得了很大的进展，例如用雷公藤治疗类风湿性关节炎、白塞病; 治疗多种肾病取得较佳效果[3]，另外雷公藤还能有效治疗子宫肌瘤、Graves 眼病和多种皮肤病[4 ～ 7]。雷公藤成分复杂，至今国内外学者已从雷公藤属植物分析出近 70 种成分，主要为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及多糖类[8]。但对于雷公藤这些化学成分的研究目前也主要集中在生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类[9，10]。中药治疗糖尿病具有疗效稳定、毒副作用小等优点[11]，雷公藤的降血糖作用虽为人们所知，但其具体的降血糖的有效部位是什么目前尚未见有关报道。我们在前期工作中通过活性示踪法发现雷公藤降血糖的有效部位是它的多糖成分，因此，本课题拟采用正交实验法获得雷公藤粗多糖，选出最佳的实验条件，为开发雷公藤成为新的治疗糖尿病的药物提供实验依据。多糖的提取方法有溶剂提取法、酸提取法等[12]; 除蛋白的方法有 Sevage 法、三氯乙酸法等[13]。雷公藤多糖的提取与含量测定已被梁惠花，刘晓河等人进行了研究[14]，为雷公藤的提取、测定奠定了基础，沈萃，谢三都，徐芳等人对紫苏叶多糖进行了纯化工艺正交实验的设计[15]，其中的正交设计实验为雷公藤的纯化理论依据。因此，本课题拟先对单因素进行优化，然后运用正交实验的方法对相关工艺参数进行优化，为纯化雷公藤多糖提供实验依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料 本实验研究的雷公藤采摘于广西，经广西中医药大学蔡毅教授鉴定为卫矛科雷公藤属植物，提取雷公藤多糖部位是打碎的根和叶。
1. 2 试剂 无水碳酸钠、氢氧化钠等均为分析纯 AR、500g( 成都市科龙化工试剂厂) ; 30% 过氧化氢、石油醚 60 - 90℃、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇均为分析纯( 成都市科龙化工试剂厂) ; 四水酒石酸钾钠( 广东光华科技股份有限公司) ; 苯酚( 广东光华科技股份有限公司) ; 葡萄糖 - 水( 天津市光复科技发展有限公司) ; 硫酸铜( 硫酸铜天津市光复科技发展有限公司) ; 牛血清白蛋白 V5g A8020 - 5( 北京索莱宝科技有限公司) ; 福林酚 F8060 - 500( 北京索莱宝科技有限公司) 。
1. 3 仪器 UV -1780 紫外可见分光光度计[岛津仪器( 苏州) 有限公司]; SH - B95 循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ; HWS -12 电热恒温水浴锅( 上海齐欣科技仪器有限公司) ; BSA224S 电子天平[赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司]; ST16R 高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技( 中国) 有限公司]; UPK - 11 - 20L 优普系列超纯水器( 四川优普超纯水科技有限公司) ; DHG - 9203A 电热恒温鼓风干燥箱( 上海齐欣科技仪器有限公司) ; 715 玻璃比色皿( 宜兴市中科工业玻璃有限公司) ; DF -101S 集热式恒温加热磁力搅拌器( 巩义市予华仪器有限责任公司) ; GH21 微电脑数码远红外炉( 深圳市鑫富达机电有限公司) 。
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2 方法与结果
2. 1 雷公藤多糖的提取流程 雷公藤根和叶→粉碎→提取→雷公藤多糖水提取溶液。
2. 2 雷公藤多糖损失率的测定 将葡萄糖 - 水标准样为基准，参照苯酚 - 硫酸法[16]测定雷公藤多糖含量。用葡萄糖 - 水标准曲线绘制的测定方法，测定雷公藤多糖提取液脱蛋白前后多糖含量，并参照公式[15]计算雷公藤多糖损失率:
雷公藤多糖损失率( % ) = [( M0 - M1 ) /M0]× 100 % 式中: M0 表示脱蛋白前雷公藤多糖质量( mg) ; M1 表示脱蛋白后雷公藤多糖质量( mg) 。 2. 3 雷公藤多糖脱蛋白率的测定 参 考 2015 年 版《中 国 药典》[17]，对照液的制备，除另有规定外，去血清白蛋白( 牛) 对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加去离子水溶解，制成 0. 2mg ·ml - 1 的溶液。
测定法: 精密量取对照品溶液 0. 0 ml，0. 2 ml，0. 4 ml，0. 6 ml，0. 8 ml，1. 0 ml，分别置试管中，各加水至 1. 0 ml，再分别加入碱性铜试液 5. 0 ml，摇匀室温放置 10min，各加入福林酚试液 0. 5 ml 立即混匀，室温放置 30min，紫外 - 可见分光光度计( UV - 1780) 在 650 nm 的波长处测定吸光度[17，18]。
将经提取得雷公藤多糖提取液经醇沉后脱色，脱色后的溶液再进行 Sevage 试剂法脱蛋白。参照文献[17] 中蛋白质含量测定方法，并参照公式[15]计算雷公藤多糖损失率:
雷公藤多糖脱蛋白率( % ) = [( G0 - G1 ) /G0]× 100% 式中: G0 表示脱蛋白前雷公藤质量( mg) ; G1 表示脱蛋白后雷公藤多糖的蛋白质质量( mg) 。
2. 4 雷公藤多糖脱蛋白工艺的单因素实验 将雷公藤多糖脱蛋白率和雷公藤多糖损失率为测定指标，以水提取液与乙醇的比例，Sevage 试剂法进行雷公藤多糖脱蛋白的单因素实验。
2. 4. 1 水提取液与乙醇的比例 添加无水乙醇到水提取液中，乙醇体积分数为 60% ，醇沉后溶液分有上下两层，抽滤后，加同等水提取液体积去离子水溶解，并加入加 30% 过氧化氢使含量到达 5% ，暴晒去过氧化氢后，测定雷公藤多糖脱蛋白率和多糖损失率，同法测定体积分数为 70% 、80% 、90%[19]。
2. 4. 2 氯仿与正丁醇体积比 振荡时间 30 min，雷公藤多糖脱色液与 Sevage 试剂体积比为 1∶ 1 ，3000 r·min - 1 离心 5 min，取水层，有机层有机层重复脱蛋白 1 次[15]，合并水层，测定雷公藤多糖脱蛋白率和多糖损失率，氯仿与正丁醇体积比分别为 2∶ 1，3 ∶ 1，4∶ 1 和 5∶ 1 同法测定。
2. 4. 3 脱色液与 Sevage 试剂体积比 氯仿∶ 正丁醇 = 3∶ 1，振荡时间 30 min，脱色液与 Sevage 试剂体积比为 1 ∶ 1，3000 r· min - 1 离心 5 min，取水层，有机层重复脱蛋白 1 次[15]，合并水层，测定雷公藤多糖脱蛋白率和多糖损失率，脱色液与 Sevage 试剂体积比为 2∶ 1，3∶ 1，4∶ 1 同法测定。
2. 4. 4 除蛋白次数 振摇时间 30 min，雷公藤多糖脱色液与 Sevage 试剂体积比为 2∶ 1，氯仿: 正丁醇 = 3∶ 1，3000 r·min - 1 离心 5 min，取水层[15]，有机层重复脱蛋白 1 ，2，3，4 次，合并水层，测定雷公藤多糖脱蛋白率和多糖损失率。
2. 5 正交实验优化雷公藤多糖脱蛋白工艺 在单因素实验的基础上，将雷公藤多糖脱蛋白率和雷公藤多糖损失率作为指标，选取 L9 ( 34 ) 正交表对不同水提取液与乙醇的比例( A) 、氯仿与正丁醇体积比( B) 、脱色液与 Sevage 试剂体积比( C) 、除蛋白次数 ( D) 进行实验，确定雷公藤多糖脱蛋白的最佳工艺条件。正交因素水平见表 1。
由图 1 可知，经苯酚 - 硫酸法测定葡萄糖 - 水，所得标准曲线为 Y = 10. 2965X + 0. 00784200，Y 表示在 487. 5 nm 波长处的吸光度 OD 值; X 表 示 葡 萄 糖 - 水 溶 液 浓 度 mg · ml - 1 ，R2 = 0. 99683，在 0 ～ 0. 06 mg·ml - 1 葡萄糖 - 水溶液浓度与吸光度的关系。
2. 6. 2 福林酚法测定蛋白质的标准曲线 见表 3，图 2。
由图 2 可知，经福林酚法测定蛋白质，所得标准曲线 Y = 2. 43498X + 0. 048954，Y 表示在 650 nm 波长处的吸光度 OD 值 ; X 表示牛血清白蛋白溶液浓度 mg·ml - 1 ，R2 = 0. 99898，在 0 ～ 0. 2 mg·ml - 1 牛血清白蛋白溶液浓度与吸光度的关系。
2. 6. 3 水提取液与乙醇的比例对雷公藤多糖脱蛋白效果的影响见图 3。
从图 3 可知，雷公藤多糖脱蛋白率随乙醇的含量增加，先减小后增大再减小。当水提取液与乙醇的比例为 60% 时，脱蛋白率为 87. 2% ; 继续增加乙醇的含量，脱蛋白率下降。当水提取液与乙醇的比例为 90% ，脱蛋白率为 71. 8% ，多糖的损失率为 21% 。
2. 6. 4 氯仿与正丁醇体积比对雷公藤多糖脱蛋白效果的影响见图 4。
由图 4 可知，氯仿与正丁醇体积比增加，雷公藤多糖的脱蛋白率呈上升的趋势。当氯仿∶ 正丁醇比例 = 5∶ 1 时，脱蛋白率最高为 89% ; 对于雷公藤多糖损失率，随氯仿与正丁醇体积比增加，它的趋势为先上升后下降再上升。当氯仿: 正丁醇: 比例 = 4 ∶ 1 时，多糖损失率最低为 39. 2% 。
2. 6. 5 脱色液与 Sevage 试剂体积比对雷公藤多糖脱白效果的影响 见图 5。
从图 5 中可以看出，雷公藤多糖的脱蛋白率和多糖损失率没有一定的规律，当脱色液; Sevage 试剂 = 2∶ 1 时，雷公藤多糖脱蛋白率最高为 84. 5% ，多糖的损失率为 37. 3% ，都高于其他比例。当脱色液: Sevage 试剂 = 1 ∶ 1 时，雷公藤多糖脱蛋白率为 76. 8% ，多糖损失率为最低 15. 7% 。
2. 6. 6 除蛋白次数对雷公藤多糖脱蛋白效果的影响 见图 6。
从图 6 中可以看出，雷公藤多糖脱色液的脱蛋白率和多糖损失率随除蛋白次数增加呈上升趋势。
2. 6. 7 雷公藤多糖脱蛋白工艺的正交实验 雷公藤多糖脱蛋白正交实验结果如表 4 所示。
K1，K2，K3 表示脱蛋白率的总和，Κ1，Κ2，Κ3 表示脱蛋白率的平均值; K4，K5，K6 表示多糖损失率的总和，Κ4，Κ5，Κ6 表示多糖损失率平均值; R 值表示脱蛋白、多糖损失率的极差。其中如 K1 的 237. 8、228. 2、234. 2、235. 1 分别表示 A 水提取液与乙醇的比例( 70% ) 、B 氯仿: 正丁醇( 3 ∶ 1) 、C 脱色液: Sevage 试剂( 1 ∶ 1) 、D 脱蛋白次数( 2 次) 脱蛋白总和，依次类推。
由 k 值得比较可知，选择 A1，B1，C1，D1 为水提取液与乙醇的比例、Sevage 试剂法对雷公藤脱蛋白率的最优工艺条件，经测定雷公藤脱蛋白率为 82. 4% ; 而对于雷公藤多糖损失率选择 A3， B3，C2，D1 为雷公藤多糖损失率最少的工艺条件，测定雷公藤多糖损失率为 29. 3% 。
3 讨论
根据实验室的条件考虑，提取雷公藤多糖采用水提醇沉法，此法是提取多糖最常用的一种方法，多糖是极性大分子化合物，提取时一般选择水、醇等极性强的溶剂[20]。在后期实验中我们就溶剂浸提法、酶法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法进行了对比[12]。大量的相关资料中表明，对比出各类方法的优缺点。溶剂浸提法是实际工作中应用最普遍的方法，但多糖损失率也较大; 酶解法，条件较为温和杂质易除、得率高; 超声辅助提取法节约时间，提取的有效成分高; 微波辅助提取法萃取时间短，效率高; 超临界流体萃取法萃取效率高、速度快。
对于做正交实验因素可以进一步探索，比如说，脱蛋白的时间、脱蛋白的温度等; 在摸索实验条件过程中发现，当把醇沉放在实验的最后，抽滤出来的多糖带有黏性，色素清除得不干净; 同时也应该也做活性炭对比除色素，对比在除色素时那个损失率的大小。
从图 3 结果可以发现，雷公藤多糖脱蛋白率和损失率呈现的不是趋势性的图像，应重复实验减少误差，或者是在 70% ～ 80% 水提取液与乙醇比例再设 75% 进行测定，缩小测定范围，增加准确度。
在图 4 中我们可以看到，雷公藤多糖脱蛋白率是呈上升的趋势，那么对于多糖的损失率先上升后下降。由于实验所用的氯仿带有毒，所以用氯仿的用量少，脱蛋白的效果要好，所以选了氯仿用少的作中间水平。在后期的细胞要使用到纯化的多糖，那么减少氯仿的使用，可以将氯仿对细胞的毒害降到最低。脱蛋白的方法三氯乙酸法等[13]，在后期的后期实验中可以做此来对比，可以减少氯仿的使用，减少有毒物质的使用。
在探索脱色液与 Sevage 试剂的比例对雷公藤多糖脱白效果的影响时可以发现雷公藤多糖脱蛋白率和损失率不成正比，那么则选用少的有机溶剂，起到最大脱蛋白率和最少多糖损失率。
另外，除蛋白次数的实验相当于多次萃取的实验，理论上当萃取的次数越多，所得的物质的纯度更大。在实验过程中发现，当除蛋白次数增加时，用离心机多次脱蛋白的上层溶液不好吸取，容易将下层的蛋白质吸到，所以除蛋白的次数并不是越多越好，要根据实际情况选择除蛋白的次数。
对于雷公藤的脱蛋白来说，脱蛋白率越高越好而多糖损失率越低越好。单独分析可知雷公藤多糖的脱蛋白率和多糖的损失率的最佳工艺条件并不一致。因此，根据极差分析影响因素的主次，确定最佳工艺条件。水提取液与乙醇的比例、Sevage 试剂法对雷公藤多糖的脱蛋白率来说，比较各列的极差结果 R 值后，发现 RA > RD > RC > RB，即水提取液: 乙醇 > 脱蛋白次数 > 脱色液: Sevage 试剂 > 氯仿: 正丁醇。那么对雷公藤多糖造成的损失而言，比较各列的极差结果 R 值，可以发现 RA > RD > RB > RC，即水提取液: 乙醇 > 脱蛋白次数 > 氯仿: 正丁醇 > 脱色液: Sevage 试剂。对于因素 A，即水提取液与乙醇的比例，发现雷公藤脱蛋白率和多糖损失率均位列第一，故可选用 A2 ; 对于因素 B，即氯仿: 正丁醇，对脱蛋白率最后和多糖损失率第三，此时应取 B1 或者 B2，当取 B1时，取 A2，B1，C2，D3 条件下雷公藤蛋白质损失率为 74. 2% ，多糖损失率为 36% ，当取 B2 时，雷公藤蛋白质损失率增加了 4. 3% ，多糖损失率下降 2. 7% 。所以 B 因素取 B2。对于因素 C，即脱色液: Sevage 试剂，对雷公藤的蛋白质损失率排第三而多糖损失率排最后，故取 C3 ; 对于因素 D，即除蛋白次数，可取 D1。综上所述，本实验单因素实验结果表明，水提取液: 乙醇、氯仿: 正丁醇、脱色液: Sevage 试剂、除蛋白次数对雷公藤多糖脱蛋效果影响较显著，选为正交实验研究的四个因素三水平实验对雷公藤多糖起到提取纯化的作用。雷公藤多糖提取纯化最佳工艺条件应为 A2B2C3D1 即水提取液与乙醇的比例为 80% ，氯仿与正丁醇的体积比为 4 ∶ 1，脱色液与 Sevage 试剂的体积比为 3 ∶ 1，除蛋白次数为 2 次，雷公藤多糖的脱蛋白率为 78. 5 % ，多糖损失率为 33. 3% 。该工艺提取操作简单，纯化效果良好，为后续研究提供了足够的药材来源，提取的雷公藤多糖经后续实验初步证明能将胰岛来源的胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团 ( 相关实验结果未发表) ，有望为解决临床胰岛移植治疗糖尿病面临的供体匮乏等困难提供实验依据。
SCISSCIAHCI
