发布时间：2020-03-07所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作为一种小分子内源性短肽，在物种间的序列高度保守，提示其在牙齿发育过程中参与重要的生理过程。有研究表明 AMG-CP 对成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞、牙周膜成纤维细胞的增
摘要背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作为一种小分子内源性短肽，在物种间的序列高度保守，提示其在牙齿发育过程中参与重要的生理过程。有研究表明 AMG-CP 对成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞、牙周膜成纤维细胞的增殖分化有调控作用，但是 AMG-CP 对成釉细胞生物学功能的影响尚未见报道。目的：探究不同质量浓度 AMG-CP 对成釉细胞系 ALC 细胞增殖的影响及相关机制。方法：人工合成并通过液相色谱和质谱检测 AMG-CP 合成情况。使用 xCELLigence RTCA 实时细胞分析系统观察 0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP 对 ALC 细胞增殖的影响。流式细胞仪检测 0，1，2 mg/L AMG-CP 对 ALC 细胞周期的影响。Real-time PCR 检测 0，1，2 mg/L AMG-CP 对 ALC 细胞的细胞周期蛋白 Cyclin D1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA 表达水平的影响。Western blot 检测 0，1 mg/L AMG-CP 对 ALC 细胞表达细胞增殖相关通路中 p-ERK1/2、total-ERK1/2 表达水平的影响。利用 MAPK-ERK1/2 通路抑制实验，在 ERK 阻断剂 U0126 作用下阻断 ERK1/2 磷酸化，检测 AMG-CP 对 ALC 细胞增殖能力的影响。结果与结论：①与对照组比较，AMG-CP 促进 ALC 细胞增殖，群体倍增时间降低，并存在浓度梯度依赖性; ②与对照组比较，AMG-CP 具有加速细胞周期的作用;③与对照组比较，AMG-CP 可以上调细胞周期相关基因 Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5 的表达;④与对照组比较，AMG-CP 可以上调 p-ERK1/2 表达，激活 MAPK-ERK1/2 信号通路;⑤U0126 抑制 MAPK-ERK1/2 通路激活后，AMG-CP 失去对 ALC 细胞促增殖作用;⑥以上结果证实 AMG-CP 可以激活 MAPK-ERK1/2 通路，加速细胞周期，进而促进 ALC 细胞增殖，提示 AMG-CP 具有促进成釉细胞增殖的潜能。
关键词：釉原蛋白羧基末端肽;釉原蛋白;成釉细胞;细胞增殖;细胞周期;MAPK-ERK 信号通路;牙釉质发育
0 引言 Introduction
釉原蛋白是釉基质蛋白的重要成分之一，约占釉基质的95%，是牙釉质形成、成熟、矿化的主要基质[1]。釉原蛋白是由釉原蛋白基因的可变剪接及转录后修饰形成的一种富含脯氨酸的多肽家族，由于存在可变剪接以及釉质发育过程中的酶解作用，釉原蛋白及其衍生肽组成了釉基质[2-3]。釉原蛋白是极性分子，包含疏水的N-端和亲水的 C-端，两个末端在物种间高度保守。研究表明釉原蛋白除了在釉质基质成熟和矿化中所起的直接作用外，釉原蛋白可变剪接体及其蛋白水解产物等成分也被认为具有信号传导作用[4]。早期研究主要关注于釉原蛋白的可变剪接体作为信号分子的特定作用，尤其关注于其在复杂的牙骨质形成过程的作用，能够促进牙骨质的形成和附着[5]。
基质金属蛋白酶20是在釉质发育特定阶段表达的酶，可以水解釉原蛋白产生C-末端多肽[6-7]。研究表明，釉原蛋白 C-末端的11个氨基酸组成的多肽，即釉原蛋白羧基末端肽 (C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)是重要的信号分子区段，能够对人成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞、MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨细胞前体细胞)的增殖或分化进行调控[6-9]。AMG-CP对成釉细胞的作用尚未见报道。该研究通过细胞增殖、细胞周期和通路阻断实验，研究 AMG-CP对成釉细胞系ALC细胞增殖的影响及作用机制。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学实验。
1.2 时间及地点 2018年7月至2019年2月在北京大学口腔医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 AMG-CP的合成序列及检测报告 AMG-CP的合成序列为 Ac-STDKTKREEVD-NH2( 相对分子质量为 1 347.64)，委托北京赛百盛生物科技有限公司合成。合成的AMG-CP进行了液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析。无菌去离子水溶解多肽冻干粉，按实验所需浓度稀释分装。
1.3.2 实验细胞 小鼠成釉细胞系ALC细胞(ameloblastlineage cells，ALC)由滨州医学院高玉光教授馈赠。
1.3.3 实验试剂及仪器 DMEM/F12培养基(Hyclone，美国);胰蛋白酶(Gbico，美国);胎牛血清(AWB，乌拉圭);青霉素/链霉素(Gbico，美国);BAC试剂盒(康为世纪，北京);U0126(Selleck，上海);兔源p-ERK1/2单克隆抗体， total-ERK1/2单克隆抗体和兔源GAPDH多克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国);二氧化碳恒温培养箱 (Thremo，美国);医用净化工作台(Thremo，美国);纯水系统(Millipore，美国);xCELLigence RTCA细胞分析系统检测系统(ACEA Biosciences，美国);E-Plate L8电极板 (ACEA Biosciences，美国);Odyssey双色红外荧光成像系统(Licor，美国);Nanodrop 2000(Thermo Fisher，美国); QuantStudio® 3实时荧光定量PCR仪器(Thremo，美国);荧光倒置显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞系培养 小鼠成釉细胞系ALC细胞用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，在37 ℃、体积分数为5%CO2、100% 湿度条件下培养。细胞汇合至80%时传代，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。
1.4.2 实时定量检测细胞增殖曲线 将ALC细胞按2×103 / 孔的密度接种于E-Plate L8电极板中，每孔200 μL，第2天加入终质量浓度为0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP[9]，连续6 d 用 xCELLigence RTCA 细 胞 分 析 系 统 实 时 定 量 分 析 AMG-CP对成釉细胞增殖的影响，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。
1.4.3 EdU检测细胞增殖 取对数生长期的ALC细胞制备单细胞悬液，将直径为15 mm的无菌圆形玻片加入6孔板内，将细胞以2×105 /孔的密度接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至G0期，再换为正常含血清培养基，并按分组加入质量浓度为0，1，2 mg/L的 AMG-CP 处 理 细 胞 12 ， 16 ， 20 h ; 然 后 按 照 BeyoCilckTMEdU-488细胞增殖检测试剂盒使用说明书，对细胞进行EdU-488标记染色，荧光显微镜下观察，每组随机选择3个视野拍照，采用ImageJ半定量分析增殖细胞比例。
1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期 将细胞以2×105 /孔接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至 G0期，再换为正常含血清培养基，加入终质量浓度为0，1， 2 mg/L的AMG-CP处理细胞12 h，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min;体积分数为95%乙醇固定 1 h ; PBS 洗 2 次 ， 用 含 0.1%Triton-X-100 及 50 mg/L RNaseA的PBS处理细胞30 min;离心，弃去PBS;加入适量PBS(0.5-1.0 mL)重悬细胞，300目细胞筛过滤;加入碘化丙啶染色，用流式细胞仪检测，记录细胞周期变化。
1.4.5 Real-time PCR检测细胞周期蛋白 CyclinD1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达 将细胞以2×105 / 孔接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至G0期，再换为正常含血清培养基，并加入终质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP作用4 h;Trizol提取细胞总 RNA，采用Nanodrop 2000测量吸光度A260/A280，检测RNA 样本浓度和纯度，取2 μg总RNA反转录合成cDNA，加入 PCR仪中扩增。结果采用实时荧光定量PCR分析程序分析，计算目的基因相对值=2-∆∆Ct。引物序列见表1。
1.4.6 MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126处理后AMG-CP 作用下实时定量检测细胞增殖曲线 取对数生长期的ALC 细胞，按2×103 /孔的密度接种于E-Plate L8电极板中，每孔 200 μL，孵育24 h，加入50 μmol/L MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126预处理细胞1 h，随后用含1 mg/L AMG-CP的培养液培养3 d，利用xCELLigence RTCA细胞分析系统检实时定量检测ALC细胞增殖，至抑制组细胞死亡时停止检测，绘制细胞增殖曲线。
1.4.7 MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126处理后AMG-CP 作用下Western blot 检测p-ERK1/2、total-ERK1/2的表达取对数生长期的ALC细胞，以2×105 /孔接种于6孔板内，每孔2 mL，孵育24 h，PBS冲洗1次，更换为无血清培养基同步化48 h，更换为正常培养基，并加入50 μmol/L U0126 预处理细胞1 h;随后用含1 mg/L AMG-CP的培养液培养细胞1 h，采用Western blot检测p-ERK1/2、total-ERK1/2和 GAPDH的表达。细胞用PBS洗3次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解细胞，收集蛋白样品，BAC试剂盒测定蛋白浓度，取30 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转膜系统转移至PVDF膜上，用封闭液在室温下振荡孵育1 h，按照1∶1 500浓度依次孵育抗total-ERK1/2 抗体、抗p-ERK1/2抗体，缓冲液洗涤膜3次，室温孵育荧光二抗，Odyssey双色红外荧光成像系统检测结果。
1.5 主要观察指标 ①在不同质量浓度AMG-CP作用下 ALC细胞增殖曲线及细胞倍增时间;②在不同质量浓度 AMG-CP作用下EdU荧光染色半定量分析增殖细胞比例; ③在不同质量浓度AMG-CP作用下不同细胞周期的ALC细胞数百分比;④在不同质量浓度AMG-CP作用下细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK2、MCM2、MCM5 mRNA的表达水平;⑤MAPK-ERK1/2信号通路阻断后的ALC细胞增殖曲线;⑥ MAPK-ERK1/2 信号 通 路 阻 断 后 ALC 细胞的 p-ERK1/2、total-ERK1/2表达水平。
1.6 统计学分析 相同实验每组重复3次，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据统计图采用Graphpad Prim7 进行绘图，进行方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较检验。计量资料以x _ ±s表示，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。
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2 结果 Results
2.1 人工合成AMG-CP鉴定 液相色谱对合成产物进行分选得到目的产物。质谱分析得到相对分子质量为1 347.64 的目的多肽Ac-STDKTKREEVD-NH2，见表2和图1，2。
2.2 AMG-CP对ALC细胞增殖的影响
2.2.1 AMG-CP作用于ALC细胞的增殖曲线及细胞倍增时间 与对照组相比，0.5，1，2 mg/L AMG-CP实验组标准化细胞指数增大，并且随着AMG-CP质量浓度的增加，标准化细胞指数增加越明显。各组之间差异有显著性意义 (P ≤ 0.05)，见图3。细胞增殖倍增时间呈浓度梯度下降趋势，各组差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，然而0.5， 1 mg/L组的细胞倍增时间在数值上接近，其生物学意义不大，见图4。
2.2.2 EdU染色检测AMG-CP对ALC细胞增殖的影响 AMG-CP作用20 h后，随着AMG-CP的质量浓度增加，明亮的绿色荧光逐渐增强，见图5。12 h及16 h的荧光标记结果类似，20 h最为显著，因此作为结果展示。使用ImageJ 软件对EdU染色结果做半定量分析，结果显示2 mg/L AMG-CP作用12，16，20 h都有促进细胞增殖的作用，差异有显著性意义(P ≤0.05)。1 mg/L AMG-CP作用12， 16 h促进细胞增殖的作用与对照组相比差异无显著性意义，在作用20 h后与对照组相比能促进细胞增殖，差异有显著性意义，见图6。
2.3 AMG-CP 对ALC细胞周期的影响
2.3.1 流式细胞仪检测处于不同细胞周期的ALC细胞百分比 0，1，2 mg/L AMG-CP作用12 h后，处于G1期的细胞比例降低，且随质量浓度的增加而降低;处于S期的细胞比例上升，且随质量浓度的增加而增加，与对照组相比差异有显著性意义(P ≤ 0.05)。实验组和对照组G1/G2细胞比例差异无显著性意义，见表3，图7。
2.3.2 AMG-CP作用下ALC细胞周期蛋白CyclinD1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达 1，2 mg/L AMG-CP 作用4 h后，CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达均较对照组(0 mg/L)有显著增高，差异有显著性意义 (P ≤ 0.05)，但1 mg/L与2 mg/L组之间差异无显著性意义，见图8。
2.4 AMG-CP作用下ALC细胞MAPK-ERK1/2信号通路中 p-ERK1/2、total-ERK1/2的表达 1 mg/L AMG-CP激活 ALC细胞中ERK1/2磷酸化(P ≤ 0.05)，对total-ERK1/2蛋白没有影响，见图9。
2.5 AMG-CP对ALC细胞中p-ERK1/2表达作用被阻断剂 U0126阻断
2.5.1 U0126 阻 断 细 胞 MAPK-ERK1/2 信 号 通 路 后 ， AMG-CP对ALC细胞增殖的实时动态检测结果 MAPK抑制剂U0126处理后细胞增殖受抑制，作用20 h后生长曲线出现转折点，细胞数量下降。当50 μmol/L U0126抑制剂与 1 mg/L AMG-CP同时作用时，细胞增殖的总体趋势是抑制的，在细胞数量增加阶段，50 μmol/L U0126抑制剂+1 mg/L AMG-CP组与50 μmol/L U0126抑制剂组比较差异无显著性意义，在细胞数量下降阶段，50 μmol/L U0126抑制剂+ 1 mg/L AMG-CP组与50 μmol/L U0126抑制剂组比较差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，见图10。
2.5.2 U0126 阻 断 细 胞 MAPK-ERK1/2 信 号 通 路 后 ， AMG-CP对ALC细胞中p-ERK1/2、total-ERK1/2表达的影响 通过ERK抑制剂U0126阻断MAPK-ERK信号通路情况下，ALC细胞磷酸化ERK1/2的表达难以检测出来，对 total-ERK1/2蛋白没有影响，这与细胞增殖实验结果相符合，见图11。AMG-CP可以通过激活MAPK-ERK信号通路，使ERK1/2磷酸化，从而促进ALC细胞增殖。
SCISSCIAHCI
