发布时间：2020-03-17所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要:血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一种二聚体糖蛋白，能够诱导毛囊血管内皮细胞的增殖和迁移，调节毛囊周围毛细血管生成，进而影响毛囊的生长发育。已知cgVEGF164是绒山羊VEGF-A基因的一种主要剪接变体，但cgVEGF164基因是否具
摘要:血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一种二聚体糖蛋白，能够诱导毛囊血管内皮细胞的增殖和迁移，调节毛囊周围毛细血管生成，进而影响毛囊的生长发育。已知cgVEGF164是绒山羊VEGF-A基因的一种主要剪接变体，但cgVEGF164基因是否具有调控毛囊生长发育的作用目前尚不清楚。为初步探究cgVEGF164基因对毛囊生长的影响及其机制，本研究通过原核显微注射制备cgVEGF164转基因过量表达小鼠。通过HE染色法比较转基因小鼠和非转基因对照小鼠毛囊的直径和密度，利用WesternBlot检测小鼠背部皮肤中信号蛋白ERK1/2、AKT1、LEF1的磷酸化水平。本研究成功获得5只阳性cgVEGF164转基因小鼠(雌雄比为4:1，阳性率8.5%);与非转基因对照小鼠相比，转基因小鼠毛囊直径增大、密度增加;经检测转基因小鼠中ERK1/2、AKT1、LEF1的磷酸化水平均上调。结果表明，cgVEGF164基因具有促进小鼠毛囊生长的作用，推测该功能可能与cgVEGF164影响ERK1/2、AKT1和LEF1等信号蛋白的磷酸化有关。
关键词:cgVEGF164;转基因小鼠;毛囊生长;磷酸化
毛囊的性状和结构决定动物毛发的品质，研究毛囊生长调控机制对于提高产绒动物产绒量至关重要。毛囊生长所需的营养物质以及调控生长所需的各类细胞因子均由其周围血管(循环系统)提供，因而充足的血液供应是毛囊细胞生长分化的基础。哺乳动物的毛囊通常呈现周期性变化，包括生长期、退行期和休止期[1,2]。研究显示，毛囊周围的毛细微血管会随着毛囊周期的变化而变化，毛细微血管在毛囊生长期比较发达，进入退行期后逐渐退化[3~5]。
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一种由二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，能够促进血管再生和调节血管渗透性[6,7]。研究证实，VEGF通过与血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)相互作用，促进血管内皮细胞的增殖和迁移[8,9]。皮肤中VEGF基因的表达水平在毛囊生长期上调，进入退行期后逐渐降低，在休止期则基本消失[4,6]。在小鼠毛囊结构中，VEGF基因主要在外根鞘和毛乳头中表达[10]，进而诱导毛囊周围毛细血管的形成，促进外根鞘和毛乳头细胞的增殖[11,12]，增大毛囊直径和毛干长度[13]。
由于mRNA剪切方式的不同，在人中已发现7种VEGFmRNA剪接变体，包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF148和VEGF206[14~16]。已知cgVEGF164是绒山羊VEGF-A基因的一种主要剪接变体，在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺中都有表达，与人源VEGF165基因的同源性高达94%[17]。已有研究证实VEGF165基因能够促进毛发生长[18~20]，而cgVEGF164基因是否具有调控毛囊生长发育的作用目前尚不清楚。本研究旨在通过原核显微注射法，获得cgVEGF164转基因小鼠，比较转基因小鼠与非转基因对照小鼠毛囊的直径和数量以及相关信号蛋白ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平的变化，探讨外源基因cgVEGF164对毛囊生长的影响及调节机制，为利用现代生物学技术手段提高产绒动物的产绒量提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
BDF1雌鼠、CD-1雄鼠、C57小鼠均由内蒙古大学国家清洁级实验动物繁育室提供。所有研究符合内蒙古大学动物伦理委员会的规定并授权。K14-cgVEGF164载体由内蒙古大学王志钢教授提供[17]，其启动子为Keratin14(K14)，外源基因为cgVEGF164。
1.2注射用外源基因的制备
用限制性内切酶BglⅡ对K14-cgVEGF164质粒载体进行线性化酶切，获得线性化K14-cgVEGF164质粒载体。用乙醇沉淀法对线性化K14-cgVEGF164质粒载体进行纯化，最后用TE缓冲液溶解并调整浓度为1.5ng/µL。用分光光度计测定OD值，OD值在1.7~1.9之间才可注射。
1.3原核显微注射
原核显微注射法制备转基因小鼠参考文献[21]中的方法。将6~7周龄性成熟的BDF1母鼠与CD1公鼠合笼，20h后取见栓母鼠的受精卵。将1×10-6µL左右含K14-cgVEGF164质粒载体的注射液注入胚胎雄原核，注射完毕后将胚胎移入KSOM培养液，放入CO2培养箱。30min后选取25~30枚注射后存活胚胎移入经麻醉处理的假孕母鼠输卵管壶腹部。移植后将假孕母鼠放置于保温板上待其苏醒后放回鼠房，怀孕成功母鼠约19天后分娩产仔。
1.4PCR检测
根据K14-cgVEGF164质粒载体的序列信息，设计一对用于检测外源基因整合的PCR引物。引物信息：
F：5'-CAGGGTCCGATGGGAAAGTGTA-3';
R：5'-TGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGA-3'。扩增产物为675bp，产物横跨K14启动子和cgVEGF164基因。待出生幼鼠长至3周时，剪取约0.5cm尾尖提取基因组DNA，进行PCR鉴定，确定转基因阳性小鼠。PCR扩增条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃复性42s，72℃延伸45s，共30个循环;最后再72℃延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5qRT-PCR分析
取10周龄cgVEGF164转基因小鼠为实验组，保留同窝的阴性小鼠为非转基因对照组。脱毛后剪取背部皮肤组织，液氮研磨后加入800µLRNAisoPlus，按RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA，利用反转录试剂盒(TaKaRa，日本)合成cDNA。qRT-PCR扩增体系为20µL，包括：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10µL，上、下游引物各0.4μL，RoxReferenceDye(50×)0.4µL，ddH2O6.8µL，cDNA2µL。qRT-PCR扩增条件：95℃预变性30s;95℃变性10s，60℃延伸30s，40个循环，每个样品进行3次重复。根据每个样品与内参基因GAPDH所得的Ct值，利用2-ΔΔCt公式分析目的基因cgVEGF164mRNA的相对表达量。目的基因cgVEGF164和内参基因GAPDH的扩增引物见表1。
1.6WesternBlot检测
取转基因小鼠和同窝非转基因对照小鼠皮肤组织，放于1.5mL离心管内剪碎，RIPA裂解液裂解细胞，收集蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜。封闭后，相应一抗(VEGF164ab53465、α-tubulinab15246、ERK1/2ab17942、P-ERK1/2ab50011、AKT1ab32505、P-AKT1ab66138、LEF1ab137872、P-LEF1ab74067均购自美国Abcam公司)4℃孵育过夜，羊抗兔二抗(ab6721购自美国Abcam公司)室温孵育1h。最后利用Tanon5200全自动化学发光成像分析系统进行曝光处理。
1.7HE染色与免疫荧光
选取cgVEGF164转基因小鼠和同窝非转基因对照小鼠的背部组织进行固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡、苏木精与伊红染色。VEGF164一抗(1∶200)过夜孵育，羊抗兔二抗(ab6717购自美国Abcam公司)(1∶1000)孵育1h进行免疫荧光染色。
1.8数据分析
cgVEGF164mRNA和VEGF164蛋白的相对表达量，毛囊的直径、密度，ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平等数据均以平均数和平均数的标准差表示，采用GraphPadPrism6软件进行统计学分析，所有数据均进行3次以上重复实验。P>0.05表示没有统计学差异，用“N.S.”(Nosignificance)表示;P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，具有统计学意义。
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2结果与分析
2.1cgVEGF164转基因小鼠的鉴定
本研究共移植原核注射胚胎296枚，获得59只仔鼠，经PCR法初步鉴定共获得5只转基因小鼠(图1A)，其编号分别为878号、890号、1008号、1018号和1021号，阳性率为8.5%。将F0代cgVEGF164转基因小鼠和野生型C57小鼠交配，获得F1代小鼠。将F1代cgVEGF164转基因小鼠自交获得F2代cgVEGF164转基因小鼠。出生仔鼠用与原代小鼠相同的鉴定方法进行鉴定。所有F0代转基因阳性小鼠都能够将外源基因传递给子代(表2)。其中1008号小鼠共获得6只F2代cgVEGF164转基因小鼠，其编号分别为1311、1313、1316、1317、1319和1322(图1B)。
2.2转基因小鼠cgVEGF164mRNA及蛋白表达水平的检测
利用qRT-PCR、WesternBlot和免疫荧光染色检测5只转基因小鼠与同窝非转基因对照小鼠皮肤cgVEGF164mRNA及蛋白的相对表达量。结果显示，890、1008、1018、1021号转基因阳性小鼠中cgVEGF164mRNA及VEGF164蛋白的相对表达量均高于同窝非转基因对照小鼠，而878号转基因阳性小鼠中cgVEGF164mRNA及VEGF164蛋白的相对表达量与其同窝非转基因对照小鼠没有显著性差异(图2，A~D)。890号转基因阳性小鼠cgVEGF164mRNA相对表达量最高，是同窝对照小鼠886号的6.25倍(图2A);1008号转基因阳性小鼠VEGF164蛋白表达量最高，是同窝对照小鼠1013号的1.68倍(图2，B和C)。经免疫荧光染色，发现VEGF164蛋白主要分布于毛囊球部(图2D)。
2.3转基因小鼠cgVEGF164mRNA组织表达谱检测及表型分析
为探究cgVEGF164在转基因小鼠各组织中的表达水平，本研究将1008号cgVEGF164转基因小鼠F2代作为实验组，其同窝的非转基因小鼠作为对照组，观察实验组与对照组小鼠表型的变化，并利用qRT-PCR检测转基因和非转基因小鼠各组织中cgVEGF164mRNA表达水平。结果表明，与非转基因对照小鼠相比，8周龄cgVEGF164转基因小鼠的表型无异常变化，生长状况良好(图3A)。转基因小鼠脑、脂肪、肌肉、肝脏、肺、脾脏、肾脏、心脏、胃、大肠、小肠、睾丸、卵巢等组织中cgVEGF164mRNA的相对表达量均高于皮肤组织(图3B);与非转基因对照小鼠相比，cgVEGF164在转基因小鼠脑、脂肪、肌肉、肝脏、肺、脾脏、肾脏、心脏、胃、大肠、小肠、睾丸、卵巢等组织中的表达量并没有显著升高(图3C)，这可能与K14启动子是表皮特异启动子有关，表明外源cgVEGF164基因对转基因小鼠其他组织的影响比较小。
2.4cgVEGF164基因对小鼠毛囊生长的影响
本研究将1008号cgVEGF164转基因小鼠F2代作为实验组，其同窝非转基因小鼠作为对照组，待小鼠生长到10周龄时，将两组小鼠背部剃毛后，取背部组织制备组织切片，经HE染色后观察。结果显示，与非转基因对照小鼠相比，转基因小鼠的毛囊直径明显增大(图4A)，毛囊密度显著升高(图4B)。转基因小鼠毛囊深入真皮层，而非转基因对照小鼠毛囊在真皮层比较浅的位置(图4C)。
2.5VEGF下游信号通路蛋白的检测
利用WesternBlot方法检测转基因小鼠与非转基因对照小鼠VEGF下游蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、AKT1、P-AKT1、LEF1、P-LEF1的相对表达量，α-tubulin作为内参蛋白，结果如图5A所示。通过灰度值计算P-ERK1/2、P-AKT1、P-LEF1分别占ERK1/2、AKT1、LEF1表达量的百分比，结果发现转基因小鼠中P-ERK1/2/ERK1/2、P-AKT1/AKT1、P-LEF1/LEF1分别为44%、51%、11%，均高于对照组18%、11%、8%(图5B)。
3讨论
转基因动物是指通过转基因技术将外源基因整合到动物的基因组中，从而使外源基因在动物体内表达并且可以稳定遗传[22]。建立转基因动物模型，对研究外源基因在动物体内的功能和表达调控机制具有至关重要的作用[23,24]。本研究利用原核显微注射技术制作cgVEGF164转基因小鼠模型，旨在研究cgVEGF164基因对小鼠毛囊生长的影响。经PCR初步鉴定，确定5只小鼠成功转入了cgVEGF164基因(编号分别是878、890、1008、1018、1021)，阳性率为8.5%。经qRT-PCR和WesternBlot进一步检测分析，获得4只高表达cgVEGF164的转基因阳性小鼠(编号分别是890、1008、1018、1021)。878号小鼠虽然成功转入了cgVEGF164基因，但其cgVEGF164mRNA和蛋白表达量不高于非转基因对照小鼠，推测原因可能是由于本研究中构建的转基因表达载体属于随机整合载体，外源基因虽然发生了基因组整合，但其转录和蛋白质表达效率将受到整合位点的影响而不可预测。由于K14启动子是表皮特异启动子，因而与非转基因对照小鼠相比，cgVEGF164基因在转基因小鼠脑、脂肪、肌肉、肝脏、肺、脾脏、肾脏、心脏、胃、大肠、小肠、睾丸、卵巢等组织中的表达量并没有显著升高。
cgVEGF164基因编码一段由190个氨基酸构成的多肽，其N端的26个氨基酸序列与人源VEGF165的N端完全相同，属信号肽序列，推测该序列与其分泌功能有关[25,26]。VEGF是血管再生的关键因子，通过促进毛囊周围毛细血管的生长，进而影响毛发生长和毛囊周期[27]。本研究使用HE染色法对小鼠背部组织切片进行染色观察，结果发现，与非转基因对照小鼠相比cgVEGF164转基因小鼠毛囊的直径和密度均增加，毛囊深入真皮层，表明cgVEGF164基因具有促进毛囊生长的作用。
为进一步探究cgVEGF164基因参与小鼠毛发生长的调节机制，本研究通过检测信号蛋白ERK1/2、AKT、LEF1的磷酸化水平初步确定cgVEGF164与MAPK/ERK1/2、PI-3K-AKT1/PAK和Wnt/β-catenin/LEF1等信号通路的联系。ERK1/2、AKT1、LEF1是与VEGF信号通路相关的下游信号蛋白，在促进毛发生长和调节毛囊周期中扮演重要角色。ERK1/2是MAPK家族成员之一，参与VEGF调节表皮细胞的增殖[1,12,28,29]。AKT也是MAPK家族成员之一，能够与VEGFR作用促进表皮细胞的存活和增殖[15,30]。LEF1是Wnt途径中主要成员之一，与β-catenin蛋白结合作用于VEGF，调控毛囊周期促进毛发再生[31~33]。研究结果显示，cgVEGF164转基因小鼠背部上皮中ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平均高于非转基因对照小鼠，由此我们推断cgVEGF164基因通过促进RK1/2、AKT1、LEF1磷酸化调控毛囊的生长。但是，毛囊的生长是多种生物因子综合作用的结果，cgVEGF164基因调控毛囊生长的分子机制还需要进一步深入研究。
SCISSCIAHCI
