发布时间：2020-04-14所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 硫酸软骨素(chondroitinsulfate，CS)作为一种具有天然活性的酸性粘多糖类物质，广泛的存在于动物组织，尤其是软骨和结缔组织中。不同动物来源的Cs种类和数量各不相同造就了CS生物活性的多样性，随着对CS功能性质的研究和应用的不断深入，CS被广泛的应用于保
硫酸软骨素(chondroitinsulfate，CS)作为一种具有天然活性的酸性粘多糖类物质，广泛的存在于动物组织，尤其是软骨和结缔组织中。不同动物来源的Cs种类和数量各不相同造就了CS生物活性的多样性，随着对CS功能性质的研究和应用的不断深入，CS被广泛的应用于保健食品、药品和临床中。目前，由于原料来源、生产工艺以及使用的测定方法不同，许多文献报道的cs的产率和纯度差别很大，使得cS的质量很难控制，因此，CS的含量测定在检验生产工艺、产品进行质量控制等方面的作用也越来越重要。本文对目前常见的CS含量测定方法进行梳理总结，以期为今后的科研和实际生产提供帮助。
1CS的结构特点
要想对CS的测定方法进行研究就必需对CS的结构特点有充分的了解。CS是EhD一葡萄糖醛酸(GlcA)和N一乙酰一D一氨基半乳糖(GalNAc)硫酸酯通过6—1，3糖苷键连接成为重复的二糖单位，二糖单位间通过B一1，4糖苷键聚合而成的一类大分子多糖。根据糖醛酸种类(葡萄糖醛酸GlcA/艾杜糖醛酸IdoA)以及氨基半乳糖上硫酸基取代位置(C一4/C一6)的不同，CS有许多同分异构体¨J
2CS含量测定方法的研究进展
CS的含量测定方法大致可以分为两类，即直接测定和间接测定。直接测定不需对cS进行分解处理，不需要转换，直接测定CS本身含量，因此直接测定方法能更准确的反应CS的实际含量;而间接测定不是测定cs本身而是将cs转化成其他便于测定的物质从而确定其含量。但由于CS分子上各种成分与其二糖单位间的相关性不一致，各种操作方法的可操作性、耗时和准确度等也不尽相同，因此在实际测定过程中要根据不同的方法进行选择。
2.1直接测定方法
由于cs为聚阴离子，因此以CS中的阴性集团作为反应指示物的直接测定方法有阳离子染色法、CPC法、电化学法、色谱法等。
2.1.1阳离子染色法
带正电的阳离子染料与CS的硫酸基和羧基生成复合物，导致染料本身的吸光度发生变化，根据反应前后吸光度的变化从而测定CS的含量。
阳离子染料的种类很多，使用不同的染料其具体测定方法也略有不同，适用范围也不同。高贵珍等用天青A对CS进行染色，在625nm波长处测定了中药复方制剂中CS的含量。由于天青A对不同的黏多糖选择性不强，测定结果容易受其他黏多糖的影响。Pospichal等通过CS与天青B反应，用流动注射分析法以分光光度检测器测定了cs含量，并分别在静态及流动状态下进行了研究j。施文健等用碱性艳蓝BO对cs进行染色，在570nln波长处测定了Cs含量，这种方法简便、快速、准确，但是对反应条件要求比较高，不易控制J。Li等将cs—A与结晶紫相互作用生成复合物，其RRS光谱比CS—A及结晶紫的RRS光谱明显增强。其复合物在328nm波长处产生新的散射光谱，检测了cS—A注射液及CS样品中痕量的CS—A，此法适用于痕量的CS检测，在实际测定中其使用范围受到一定限制J。
阳离子染色法所用的染料不同，测定时所需的条件不同，染料和CS结合的特异性和紧密性也不同，因此这种方法虽然比较简单、设备要求不高，但是受不同染料的影响其准确性也不一样，需要根据实际测定的需要进行选择。
2.1.2CPC法
CPC法是美国药典规定的CS的含量检测方法。美国药典一处方集(USP—NF)CS含量测定法依据CS为聚阴离子，可与氯化十六烷基吡啶(CPC)作用生成难溶物，适宜条件下形成稳定的混悬液，与已知浓度的CS溶液比较混悬液的透光度，可知检测CS的含量。
姬胜利等报道了用CPC法在680nm处测定cs吸光度的变化从而测定CS的含量，不需要特殊的仪器，操作简便。钟明亮等报道了用光度滴定法测定Cosequin@DS咀嚼片中的CS—Na的方法，用0.1%(w/v)CPC滴定CS—Na并在420nm下用比色计指示光度变化，比色计显示最大反应时即为终点，在选定的浓度范围内(0.6～1.4rag/mL)CS—Na标准曲线呈现良好的线性(r>10.99)，这种方法有针对性，良好的线性，准确度和精确度，非常适合原材料和Cosequin~DS咀嚼片中的cS—Na的定量测定，不需酶解酸解，直接测定，快速准确，4～5min/样】。刘坤等报道了用CPC法快速测定Cs含量的方法，在波长680nm处测定CS在0～625g/mL范围内具有良好的线性关系，r：0.998，方法回收率为98.49%，RSD为1.11%。该测定方法与氨基己糖法相比简便快速，重现性好J。张关顺报道了将cS对照品用水溶解，加入pH值7.2磷酸盐缓冲溶液5mL，定容后用CPC滴定，以电位指示终点，求得校正因子，再用同法测样品，计算含量。这种方法更简便，不用空白，但对电压的稳定性要求较高。刘宪锋等在报道膜技术在CS生产上的应用中使用CPC滴定仪测定cs含量，更为便捷…。
这种方法相对来说比较稳定，结合仪器进行测定方便快捷，准确性也较高，目前已经得到国内外的认可。
2.1.3电化学法
Sun等用派洛宁B作电化学探针测定了CS含量。将cS加至派洛宁B溶液中，线性扫描伏安还原峰电势无变化但电流明显降低，电流降低与浓度呈线性关系。沈建如等利用高效毛细管电泳测定原料药及片剂中cS含量，Cs在0.04—2.02g/mL的浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.9998)，平均回收率为100.2%，该法快速、简单、准确，可用于原料药及片剂中cS的含量测定¨。
电位法操作简便快速，结果准确，稳定，重现性好，杂质不干扰测定，实际操作中对测定条件如对电压稳定性要求高，在稳压稳流的情况下可得到满意结果。
2.1.4液相色谱法
赵振锋等采用高效液相色谱法对cs进行直接分析，结果表明CS在1.742～8.71mg/mL浓度范围内同峰面积呈现良好的线性关系(r=0.9998)，具有较好的重现性，此方法具有快速、准确、重复性好等优点14]。潘自国等在209nm波长处测定了CS总量，不但能直接测定CS的总量，同时还能测定了A、B、C、D等4种异构体的含量¨。
液相色谱法快速、准确、重现性好，解决了蔗糖等还原糖对含量测定的干扰，但其基线噪音高，不稳定，仪器平衡时间长，常有色谱峰拖尾，结果变异大，难以控制，而且CS相对分子量范围较广，不易选择合适的对照品。对仪器和试剂要求高，一些色谱方法需要专业的软骨素酶，价格昂贵，操作繁琐;有些需要有毒试剂，造成操作的不便，在实际生产中应根据需要进行选择。
2.2间接测定方法
间接测定方法是从CS的分子结构人手，将CS转化分解为便于测定的结构单元进行测定，常用于测定的结构单元主要有：氨基己糖、葡萄糖醛酸、二糖单元和硫酸根等。
2.2.1氨基己糖
最早的关于CS测定的方法就是Elson—Morgan，目前我国药品标准采用Elson—Morgan法测定cs含量，根据CS水解所得氨基葡萄糖与乙酰丙酮发生缩合反应，其产物与对二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈红色，测定525nm波长处吸光度。该方法操作繁琐，重现性差，谢继青等通过析因实验分析认为影响测定的主要因素是乙酰化和显色，对该方法进行了优化，增加了测定的精密度和重现性。李萍等对测定的时间条件进行了研究，分析时间比原方法缩短一半以上。
2.2.2葡萄糖醛酸
cs在酸性条件生成糠醛或其衍生物，与问苯三酚试剂反应，产物在554nm波长处有最大吸收。高华等用问苯三酚分光光度法对CS的测定进行了研究，在0.1～1.0mg/mL范围内线性关系良好(r=0.993)，具有良好的重现性。张华瑶等进行了操作条件的优化，并测定了角膜宁滴眼液中cs含量。cs中的葡糖醛酸在硫酸的作用下生成糠醛，在咔唑的醇溶液中显红色，在520nm波长处有最大吸收。该法较测定氨基葡糖法简单一些，但由于在操作过程中有浓硫酸，所以给实际操作带来诸多不便。翟咏红等用该法测定了真灵活胶囊(复方制剂)中CS的含量，制剂中的氨基葡萄糖对CS测定无干扰。4一氨基一3一肼基一5一巯基一1，2，4一三唑(AH.MT)作为显色剂，与己糖醛酸或CS显色灵敏。AH.MT在碱性溶液中与CS生成紫色衍生物，在540nm波长处测定吸光度可测定cs的含量J。刘坤等利用该法测定了软骨鱼类中CS的含量，并优化了测定条件。
2.2.3二糖单元
软骨素二糖的含量通常可采用高效液相色谱法、酶解一高效液相色谱法、反相离子对高效液相色谱法和反相高效液相色谱法测定。HitoshiOkamoto等报道了将CS用酶水解成为硫酸软骨二糖，然后用毛细管酶反应测定其含量从而建立在线分析系统。在这个系统内使用电泳迁移将酶混合物和底物Cs混合，然后在一个微弱的电场里面继续进行反应，最后在外加电场的作用下反应的产物迁移到检测器。为了减少蛋白质的吸附，使用一个聚氯乙烯酒精涂抹的毛细管。在反极性作用下，二糖成功的迁移到10mMTris—acetatebuffer(pH值7.0)的阳极，在232nm下检测。这种方法应用于滴眼液的检测，不受辅料的干扰。线性良好(r≥0.999)，回收率100.0%～100.5%，精确度0.2%～0.6%(相对标准偏差)。精密、操作简便、安全、快速、自动化，酶用量比HPLCCE少。
2.2.4硫酸根
茅力等用离子色谱法将Cs水解成等摩尔的硫酸根。用离子色谱柱将硫酸根和其他杂质分离后以电导检测器检测。测定了CS原料、注射液和鲨鱼软骨粉中cs含量_2。后来他们又用原子吸收光谱法将鲨鱼软骨粉水解后，加入已知量的钡离子使硫酸根沉淀。将样品用水浸泡后做浸泡对照。用原子吸收光谱法测得游离硫酸根，从而算出水解出的有机硫酸根的量，再换算出CS含量J。
以上这几种方法都是以cS的结构单元的一部分作为测定的基准物质，原理上相同，一般先将CS进行水解，彻底分解为单体，然后再进行衍生化显色反应。对仪器要求不高，准确度较高。但操作繁琐、费时，干扰因素多，重复性差，一些衍生物往往还具有一定的毒性，目前在这方面的研究主要是对测定条件进行优化，以达到提高准确性，简便性，缩短反应时间。
3结论
从以上对各种方法的总结我们可以发现，不同方法有其自身的优缺点，在实际测定中应该根据实际条件和对结果的要求不同选择不同的方法。不同来源，不同生产工艺的CS在含量和结构方面都不相同，而目前文献报道的CS的产率和纯度差别很大，随着全球市场CS需求量的增大，CS在保健品和临床中的应用越来越广泛，不同的产品CS含量也有差别，也需要对产品进行含量鉴定，所以CS含量测定方法不论在生产过程还是产品的质量控制过程中的作用也越来越重要。因此研究简便、便宜、快速、精确、安全、稳定、重复性好的方法依然是未来发展的去势。
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