发布时间:2020-04-23所属分类:医学论文浏览:1365次
摘 要: [摘要]目的:研究中药单体柚皮苷(NG)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化过程中MAPK信号通路的影响。方法:观察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制剂SB203580、PD98059、SP600125及3种抑制剂全部加入的情况下,各组碱性磷酸酶(AIJP)、骨钙
[摘要]目的:研究中药单体柚皮苷(NG)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化过程中MAPK信号通路的影响。方法:观察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制剂SB203580、PD98059、SP600125及3种抑制剂全部加入的情况下,各组碱性磷酸酶(AIJP)、骨钙素(BGP)、I型胶原(ColI)等骨向分化指标的差异。用Westernblotting技术检测各组p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平,用荧光定量PCR技术检测细胞因子转化生长因子B(TGF一13。)、骨形成蛋白2(BMP一2)和核心结合因子ctl(Cbfet1)mRNA的表达。结果:(1)10mol/L为本实验中NG的最佳促骨向分化浓度。(2)NG最佳浓度组的ALP和BGP含量比其它各组都高(P<0.05),ColI含量无明显差异(P>0.05);与NG组相比,加入不同抑制剂组的AIjP、BGP和ColI表达量出现不同程度的降低。(3)与空白组相比,NG组JNK蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05),p38蛋白的磷酸化水平降低(P<0.O1),ERK1/2蛋白的磷酸化水平无明显差异(P>0.05)。与NG组相比,加入不同抑制剂组的p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平有升高也有降低。(4)NG组上调BMP一2的表达(P<0.05),下调Cbfcd的表达(P<0.05),而对TGF—B。的表达无明显影响(P>0.05)。与NG组相比,加入不同抑制剂组的TGF—p1、BMP一2和CbfctlmRNA表达量出现不同程度的降低。结论:NG主要通过激活MAPK信号通路中ERK通路、JNK通路以及上调BMP一2的表达,促进MSCs的骨向分化。NG上调BMP一2的表达受MAPK通路中p38通路的影响较大。
[关键词]柚皮苷;骨髓间充质干细胞;骨向分化;MAPK信号通路
骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是在骨髓中发现的一种起源于中胚层、具有自我复制能力和多向分化潜能的非造血干细胞。MSCs向成骨细胞(osteoblast,OB)分化的特性可为骨生长及骨修复提供细胞来源,在骨性疾病的治疗上拥有非常良好的应用前景。MSCs向OB分化是个复杂的过程,涉及多种信号通路的调控,其中与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinase,MAPK)信号转导途径关系密切。已有研究表明,MAPK通路中的细胞外信号调节激酶(extracellular—signalregulatedproteinkinase,ERK)、p38MAPK和c—Jun氨基末端激酶(C—JunN—terminalkinase,JNK)通路参与了OB分化增殖的信号转导,并在应激、凋亡及骨质代谢、炎症中发挥重要作用…。
柚皮苷(naringin,NG)作为中药骨碎补主要成分之一,大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其变种的果皮及果实中。NG具有促进OB增殖和分化、抗过敏、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血脂、抑癌等多种药理活性_2J。在促进MSCs骨向分化方面虽然已有文献进行了初步研究J,但其作用机制尚不清楚。本研究采用中药单体NG对SD大鼠MSCs进行干预,观察在NG促MSCs骨向分化过程中ERK、p38和JNK通路的作用及与骨转化调控因子之间的关系。
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材料和方法
1动物
清洁级(SPF)Spragne—Dawley(SD)大鼠,雌性,3月龄,体重200g左右,购自南方医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(粤)2o06—0015。
2主要仪器和试剂
倒置相差显微镜(Olympus);CO2培养箱(Rev—CO);酶标仪(Bio—Rad);数码照相机(Gallon);扫描电子显微镜(Philips);PCR仪、稳压恒流电泳仪、IQ5RealTimePCRDetectionSystem(Bio—Rad)。
—MEM(HyClone);胎牛血清(Gibco);胰蛋白酶、TritonX一100(Amreseo);噻唑蓝(Mar)、DMSO、pNPP(Sigma);SB203580(SB,p38通路抑制剂)、PD98059(PD,ERK通路抑制剂)、SP600125(SP,JNK通路抑制剂)购自碧云天生物技术研究所;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所;大鼠骨钙素(boneglaprotein,BGP)EHSA检测试剂盒、大鼠胶原酶I(collagenaseI,ColI)ELISA检测试剂盒、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)测定试剂盒购自南京建成生物研究所;兔多克隆I抗(CellSignaling),辣根过氧化物酶(ho~eradishperoxidase,HRP)标记的Ⅱ抗(CellSignaling),Trizol(Invitro.gen);氯仿、异丙醇(广州化学试剂厂);Taq酶、反转录酶购自大连宝生物工程有限公司;引物由上海生工合成;柚皮苷购自中国药品生物制品检定所;其余试剂均为国产分析纯。
制备NG母液并设置不同浓度梯度一J。取l0mgNG溶于85LDMSO溶液中配制成0.2moUL母液。用仅一MEM完全培养基稀释母液,分别得到浓度为1×10一mot/L、1X10~mot/L、1×10mot/L、1X10~mol//L、1X10~moVL、1X10一mot/L和1X10mot/L的NG溶液。
3方法
3.1原代MSCs的分离提取与鉴定全骨髓贴壁法提取大鼠MSCs。3月龄SD雌性大鼠,颈椎脱臼法处死,置75%乙醇中浸泡10min。无菌条件下迅速分离出双侧股骨,剔净股骨上附着的脂肪结缔组织和骨膜,迅速移人超净台。将分离好的股骨放入75%乙醇中浸泡30S,随后用D—Hanks缓冲盐溶液冲洗4~5次,放人无菌培养皿内,剪去股骨两头的干骺端。用5mL注射器吸取含10%FBS的完全培养基反复冲洗骨髓腔数次,收集冲出液,用吸管充分吹打均匀,得到细胞悬液。用1mL注射器将细胞悬液按1×10cells/L的密度接种到25cm塑料培养瓶中,置37℃、5%CO、饱和湿度的培养箱中培养。24h半量换液1次,以后每3d全量换液1次。待贴壁细胞达到80%一90%融合后,传代培养。杂细胞随换液而被逐渐弃除,据差速贴壁原理,MSCs不断纯化。倒置显微镜下观察细胞形态特征,用流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD45,并用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞超微结构。
3.2细胞增殖活性测定取生长状态良好的P3代MSCs,0.25%胰酶消化后,制成单细胞悬液,以2x10"cell/)密度接种于96孔板中,每孔中的体积分别为100L,24h待所有细胞贴壁后,吸出每孔培养液,换成无血清培养基,24h细胞周期同步化后开始添加不同浓度柚皮苷。吸净每孔培养液,取配制好的不同浓度的柚皮苷工作液,按设置的浓度加入不同组别,使各组的终浓度分别为1x10-3mo/L、1x10-molL.1x10-smol/L,1x10-6molL.1x10-7mol/L,1x10-"mol/L,1x10-mol/L,空白组中仅加入完全培养基,不加NG溶液作为对照。每个浓度设6个复孔,每孔终体积200L。各组添加不同浓度柚皮背后培养3d,进行MTT检测。弃去培养液,D-Hanks液冲洗3次,更换无血清的a-MEM培养基180L/well,同时加入5g/LMTT20LL/well,置37 ℃5%CO2培养箱中孵育4h后,小心弃去上清液,加人DMSO150uL/well,置微孔板振荡器上振荡10min,在酶标仪上测吸光度(A)值,测量波长为490nm,以未接种细胞的空白对照孔作为调零孔。
3.3以ALP活性确定NG最佳促骨向分化浓度采用pNPP法检测不同浓度NG对MSCs分化中ALP活性的影响。取P3代细胞,以5x10'cella/LI密度接种到6孔板中,每孔3mL。用含10%FBS的a-MEM培养基培养6d,更换无血清培养基培养24h24h细胞周期同步化后,更换为含有不同浓度NG的完全培养基。培养72h后,吸弃孔中的培养基,用D -Hanks洗2遍。每孔加入细胞裂解液(0.1%Tritonx-100)1mL,4℃作用20min。收集裂解液采用对硝基酚磷酸盐法测定ALP浓度。以pNPP为底物,根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37C、pH10.0条件下,每分钟转化产生1umol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位。用BCA法测定裂解液中总蛋白浓度,以蛋白含量(ug)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。根据标准曲线,算出样品实际浓度(g/L),ALP活性以10U/gprotein表示。
3.4实验分组及各项指标检测确定NG最佳促MSCa骨向分化浓度后,以该浓度NG和通路抑制剂对MSCs进行干预[3-1]。实验分为6组:(1)空白对照组(control);(2)NG组;(3)NG+SB203580(NG+SB)组;(4)NG+PD98059(NG+PD)组;(5)NG+SP600125(NG+SP)组;(6)NG+3种抑制剂(NG+SB+PD+SP)。实验取P3代均质性良好的MSCs以1x10"cells/L的密度接种于24孔板,共6组,每组6个复孔。待细胞接种24h后,换入无血清培养基,24h细胞周期同步化后,再加人药物及完全培养基,每孔终体积1mL。培养板置于37℃,5%co2培养箱中继续培养:(1)空白对照组每3d正常换液1次;
(2)NG组加人最佳浓度的NG及完全培养基;(3)-(6)组在每次换液前,分别加人3umol/LSB2035804umol/LPD98059和5umol/L.SP600125预处理30min,然后加入最佳浓度的NG及完全培养基继续培养,加药后培养3d与其它各组同时取细胞上清液和细胞进行指标检测。
3.4.1ALP活性测定吸尽各孔培养液,用PBS洗3次,每孔加200uL0.1%TritonX-100,4℃冰上裂解,收集细胞裂解液,取30L加于测定管内,按照ALP试剂盒说明操作,标准管加入30uL酚标准应用液(0.02g/L),空白管加入双蒸水30山L,各管均加入缓冲液50L和基质液50uL,充分混匀,37℃水浴15min,加入显色剂150L,立即混匀,选择520nm波长,酶标仪测定各管吸光度。根据说明书上相应公式计算ALP活性,用金氏单位(King'su-nit,每克组织蛋白在37℃与基质作用15min产生1mgt为1个金氏单位)表示。
3.4.2BCP分泌测定吸弃孔中的培养液,用PBS洗2遍,每孔加人细胞裂解液200山,冰上裂解20min,收集裂解液-20℃保存待测。标准曲线制备及样品测定按说明书操作,于酶标仪上450nm波长处测定A值,并通过标准曲线计算样品中BGP含量,用4e/gprotein表示。
3.4.3Col1含量测定分别取各组的细胞培养上清液,标准曲线制备及样品测定按说明书操作,于酶标仪上490nm波长处测定A值,并通过标准曲线计算样品中Col1含量,结果用mg/gprotein表示。
3.4.4Westernbloting检測磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK和磷酸化p38的表达吸弃培养基,用PBS洗2遍,再加入细胞裂解液4℃裂解30min,12000/min离心10min取上清液,用BCA法测蛋白浓度。配制12%分离胶和5%积层胶进行SDS-PAGE电泳,每孔上样量501go以GAPDH作为内参照。电泳结束后转膜,将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭,分别加入免抗p38抗体、ERK抗体、JNK抗体、GAPDH抗体、p-p38抗体、p-ERK抗体和P-JNK抗体于4℃孵育过夜。洗膜,加入HRP标记的相应的羊抗兔1gG抗体于室温孵育1h。洗膜,ECI.显影曝光,得到胶片,比较各条带的灰度值,分析所检测蛋白的磷酸化水平。
3.4.5荧光定量PCR技术检测TGF-B,、BMP-2和CblalmRNA的表达总RNA的提取采用Trizol法进行,紫外分光光度计检测浓度,并用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。将其逆转录为cDNA以18SrRNA为内参照
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