发布时间：2020-06-09所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要：脂质不仅是细胞膜的主要组成部分，还参与一些生命活动如能量存储、信号传导等，在生命体中发挥着重要作用。近年来，越来越多的研究表明脂质的变化与一些重大疾病的发生发展密切相关，脂质组学研究对理解疾病的发生机制及过程具有重要意义。在脂质分析
摘要：脂质不仅是细胞膜的主要组成部分，还参与一些生命活动如能量存储、信号传导等，在生命体中发挥着重要作用。近年来，越来越多的研究表明脂质的变化与一些重大疾病的发生发展密切相关，脂质组学研究对理解疾病的发生机制及过程具有重要意义。在脂质分析过程中，由于样品基质的干扰或被分析物浓度的限制，通常需要对样品进行前处理，以得到最佳的分析性能。该文综述了脂质组学分析中的样品前处理技术，包括脂质的提取方法(如液液萃取、固相萃取等)和针对不同类脂质的化学衍生化技术在各领域，尤其是生命分析和代谢组学中的应用，并对脂质组学分析中的样品前处理技术的发展进行了展望。
关键词：脂质组学;样品前处理;脂质提取;化学衍生化;综述
作为代谢物的一大类重要组成部分，脂质在生命体中扮演着重要作用，如磷脂双分子层是构成细胞膜的基本骨架，可维持细胞的完整性和相对独立性;脂肪酸和甘油三酯是多种细胞的能量来源，维持细胞的基本活动与功能;许多脂质分子如类花生酸、溶血磷脂、内源性大麻素等可作为二级信号传递分子，参与细胞信号传导等。脂质组学(lipidomics)作为代谢组学(metabolomics)的一个重要分支，是对脂质及其相关结构与功能进行研究的科学，其定义为“对脂质分子种属及其在生物学上的作用，涵盖脂类代谢、功能蛋白质表达以及基因调控等因素的全面描述”[1]。根据脂质化学结构的差异，可将其分为8大类[2]：脂肪酰类(fattyacyls，FA)、甘油酯类(glycerolipids，GL)、甘油磷脂类(glycero-phospholipids，GP)、鞘脂类(sphingolipids，SP)、固醇类(sterollipids，ST)、异戊烯醇类(prenollip-ids，PL)、糖脂类(saccharolipids，SL)和聚酮类(polyketides，PK)等。每一类型的脂质由于极性头基、碳链长度或不饱和度的差异又可形成不同的结构，由此组成种类繁多、性质各异的脂质分子。越来越多的研究表明，脂质的合成或代谢异常与多种疾病密切相关，如癌症[3]、阿兹海默症[4]、动脉粥样硬化[5]等。脂质组学研究已成为生命科学研究领域的热点，面对复杂的脂质组分，发展准确、灵敏、可靠的脂质组学分析方法显得尤为重要。
相关期刊推荐：《色谱》Chinese Journal of Chromatography(月刊)1984年创刊，是专业性学术期刊，主要报道色谱学科的基础性研究成果、色谱及其交叉学科的重要应用成果及其进展，包括新方法、新技术、新仪器在各个领域的应用，以及色谱仪器与部件的研制和开发。适于科研院所等从事色谱基础和应用技术研究的科研人员、色谱及其相关学科的硕士及博士研究生、分析测试领域的基层科研人员、色谱仪器开发及经营单位的有关人员阅读。
目前，质谱(MS)已成为脂质组学研究中最有效的技术手段之一。基于MS的分析方法主要可分为3种：利用MS直接进样检测的“鸟枪法”，与其他分离技术如液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳(CE)等结合的联用方法，以及可实现样品空间分布的质谱成像(MSI)方法。脂质组学研究对象通常是基质复杂的生物样品，如血清、血浆、尿液、组织等，除MSI方法外，在进行分析前往往需要对样品进行富集和提取。提取后的脂质在MS检测时可能仍会面临灵敏度低等问题，这就需要对样品做进一步处理，化学衍生化是解决该类问题的有效手段之一。本文针对脂质组学分析中的样品前处理技术，以脂质化合物提取方法与衍生化技术为重点进行了评述，并对其发展趋势进行了展望。
1脂质的提取与富集技术
通常生物样本采集后直接利用液氮快速冷冻，之后放入低温(如-80℃)环境储存，从而尽量减少样品中各类物质发生改变[6]。在进行分析前，液体样品在4℃条件下复溶，然后进行充分混合;固体样品则可借助研钵或匀浆机，通过加入适当溶剂完成混合[7]。
常用的脂质提取技术主要包括液液萃取(LLE)与固相萃取(SPE)两种方式。由于LLE可提取出较为全面的脂质分子，适用于非靶向全脂分析;SPE过程使样品经过分离和富集步骤，进一步除去干扰物质，提高被分析物的浓度，更适用于某一类或某几类脂质分子的靶向代谢组学分析。
1.1液液萃取
生物样品中蛋白质的存在会影响脂质分析方法的精确度与准确性，如不提前去除，可能缩短仪器的使用寿命[8]。为了减少样品损失，前处理步骤应尽可能少，相对简单的操作是将蛋白质沉淀与脂质提取一步完成。Zhao等[9]提出一种向血样(血清或血浆)中加入过量甲醇的简单提取方法，用来分析人血中的磷脂和溶血磷脂。t’Kindt等[10]用同样的方法提取了人皮肤中的神经酰胺，其中一部分利用电喷雾电离-质谱(ESI-MS)的负离子模式进行分析，而另一部分提取液经SPE提取后在正离子模式条件下进行分析，两部分结果总计鉴定到264种神经酰胺分子。
由于复杂的脂质分子间极性存在巨大差异，一种溶剂的提取方法已不能满足全脂分析的需求，混合溶剂的单相提取方法得到了发展。Pellegrino等[11]开发了一种全脂分析方法，他们向50μL血清中加入1mL甲醇-甲基叔丁基醚(MTBE)-氯仿(1.33∶1∶1，v/v/v)混合溶液(MMC)，经过涡旋、离心后用LC-MS进行分析。结果表明，血清中9种脂质的回收率接近100%。Calderón等[12]在Sarafian等[13]工作的基础上，以宫颈癌Hela细胞为分析对象，比较了两种单相异丙醇-水混合体系(75∶25，v/v和90∶10，v/v)与传统两相萃取体系(Bligh-Dyer法[14]和Matyash法[15])的性能。结果发现，异丙醇-水(90∶10，v/v)的萃取效果与Matyash法相当，并且优于另两种方法。除此之外，研究人员报道了多种单相萃取体系用于脂质组学分析，如氯仿-甲醇(2∶1，v/v)[16]、正丁醇-甲醇(1∶1，v/v)[17]体系等。Jurowski等[18]就用于脂质组学分析的单相混合溶剂进行了综述。
LLE是脂质组学中使用最广泛的萃取方法。与单相溶剂萃取体系不同，LLE利用被分析物在两种互不相溶的溶剂中分配系数的差异实现不同物质的分离。脂质组学分析中应用最多的LLE方法有3种：Folch法[19]、Bligh-Dyer法和Matyash法。其中Folch法使用氯仿-甲醇-水(8∶4∶3，v/v/v)混合溶剂对生物样品进行全脂提取，Bligh-Dyer法在上述方法的基础上进行了改进，使用相同溶剂体系但不同体积比(2∶2∶1.8)，以此减少溶剂用量，缩短提取时间，并且还可减少有毒试剂氯仿的使用。氯仿与甲醇的混合体系能在多种复杂基质中非选择性地提取出各种脂质分子，水相的加入可以增强相分离，减小脂质在水相中的溶解度，从而提高萃取效率。为了减小溶剂毒性，Carlson[20]用二氯甲烷替代氯仿进行血清和组织的脂质萃取。然而，上述方法在进行脂质提取时，含有脂质的有机相位于两相溶液的下层，无论是直接移取下层溶液还是去除上层液体，都面临可能造成溶液污染或样品损失的问题。
Matyash等[15]使用低密度的MTBE与甲醇和水组成的混合溶液(10∶3∶2.5，v/v/v)作为萃取溶剂对鼠脑和人血浆进行全脂分析，并与Folch法和Bligh-Dyer法进行对比。结果表明，在4种不同的基质中，Matyash法的回收率与其他两种方法的结果相当甚至更好。使用MTBE代替氯仿，降低了溶剂的毒性和致癌性，并且含脂质的有机相位于两相溶液的上层，简化了相分离步骤。Lfgren等[21]提出了另一种基于丁醇和甲醇的无氯仿体系(BUME)，他们向75μL血浆中加入300μL丁醇-甲醇(3∶1，v/v)溶液后，再加入300μL庚烷-乙酸乙酯(3∶1，v/v)溶液和300μL1%(v/v)乙酸水溶液进行全脂萃取。整个萃取过程在96孔板中进行，在60min内即可实现96份样品的提取。该方法分析速度快，自动化程度高。
近几年来，基于LLE方法的脂质组学在多个领域开展应用，所用的萃取体系多是在上述传统方法基础上进行改进。Buyer等[22]在Bligh-Dyer溶剂的基础上加入了0.25mol/L碳酸氢铵，以萃取分析土壤中的磷脂脂肪酸(PLFA)，这种挥发性盐的加入不仅使PLFA的萃取效率提高，也提高了土壤中其他代谢物的提取效率。Sostare等[23]则通过改变Matyash溶剂的体积比(MTBE-甲醇-水的体积比由10∶3∶2.5改为2.6∶2.0∶2.4)提高分析方法的萃取效率和重现性。Ren等[24]利用4种方法提取微藻样品中的脂质时，在每种方法的两步提取过程间增加一步纯水相提取步骤。结果表明，增加水相处理步骤后脂质萃取效率大大提高，提取的脂质中甘油三酯的比例有所提高，这在生物柴油的生产领域非常有用。Ulmer等[25]考虑到上述3种最常用方法的萃取溶剂体积可能会随样品基质的不同有所改变，他们以人血浆样品为研究对象，对3种方法所用样品与萃取溶剂的体积比分别进行了优化。除此之外，不同方法对相同样品萃取效果的比较也有诸多研究报道[11，12，26，27]。
1.2固相萃取
SPE是利用不同物质在固液两相中相互作用的差异实现分离的，其具体操作是先使被分析物吸附到固定相上，然后使用不同洗脱能力的溶液(流动相)分步洗脱，实现样品的分离、纯化与富集，SPE常被用于脂质的萃取。一般来说，SPE常用于LLE之后，目的是去除萃取液中的干扰物质或特异性富集某一类或某几类脂质，以用于靶向脂质组学分析。
Hewelt-Belka等[28]先用Bligh-Dyer法对母乳进行全脂萃取，上层水相含有的极性代谢物通过亲水相互作用色谱(HILIC)-MS进行分析，另一份样品用HybridSPE-Phospholipid柱处理，将含有磷脂的洗脱部分与LLE的下层有机相合并后进行RPLC-MS分析。该方法可同时获得母乳中高丰度甘油糖脂与低丰度甘油磷脂和鞘脂类的信息，是一种可对母乳进行全脂分析的半定量方法。Flieger等[29]使用Cu2+修饰的硅胶柱用于血浆样品中磷脂的去除。在探究去除磷脂方法的方面，Warren[30]用硅胶作为固定相，氯仿、丙酮、甲醇依次进行洗脱，验证甲醇洗脱液中是否只含有磷脂，结果发现甲醇洗脱下来的部分除含磷脂外，还有多种其他极性脂质。目前已有多种商用化SPE固定相用于脂质组学分析，常用的为硅胶基底，如C8柱或C18柱以及非键合或键合了氨基、氰基、二羟基或氨丙基的硅胶柱等[31]。硅胶柱和氨丙基柱常被用于分离中等极性和极性脂质，而C8柱和C18柱则被用于从水相样品的极性物质中分离脑苷脂、神经节苷脂和脂肪酸等物质[31]。
相对于SPE，固相微萃取(SPME)使用溶剂量少，分析速度快。SPME常使用一根带有涂层的纤维用于萃取分析物，基于静电作用、离子交换作用、疏水相互作用等作用力，目前使用较多的涂层有聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚苯胺(PANI)等[32]。Garwolińska等[33]将一根表面修饰PAN-C18的纤维用甲醇-水(1∶1，v/v)混合溶剂活化20min后直接插入1mL母乳中，经过5min吸附后，再放入100μL异丙醇中进行洗脱，5min后取出该纤维，洗脱液直接用于LC-MS分析。该方法分析速度快，操作简便，适用于母乳的全脂分析，并且该方法通过MS的轮廓分析可以区分母乳、配方奶粉和牛奶样品。Deng等[34]则使用一种生物相容性材料作为探针的涂层，开展原位、体内和微尺度的脂质组学研究。他们将表面修饰有亲水性壳聚糖聚合物的钨针直接插入斑马鱼、大型溞和单个真核细胞内进行萃取，洗脱后用纳升电喷雾电离(nanoESI)-MS进行检测。与传统的鸟枪法相比，该方法检测到的脂质结果相似，但样品消耗量少，分析时间短。
SPME技术常与GC或GC-MS结合用于挥发性物质的分析，如顶空-GC(HS-GC)的进样针首先在一定条件下对固体、液体或气体样品进行萃取吸附，进而在进样口实现洗脱/解吸附并完成进样。此外，SPME也可与全二维GC(GC×GC)分析结合，借助高灵敏的质谱检测技术用于环境污染物和农用化学品的检测[35]。目前，SPME结合GC-MS已成功用于多种样品中脂肪酸或脂肪酸酯的分析，如水果[36]、牛奶[37]、白酒[38]等。尽管SPE/SPME方法所用小柱或涂层容易达到饱和，成本较高，但具有样品和溶剂消耗少、分析速度快、易于自动化的优点，适用于极少量样品、大规模样品及原位分析。
1.3其他萃取技术
近年来，除了LLE与SPE方法外，许多其他方法也已用于脂质组学样品前处理中，如微波辅助提取法(MAE)、超声辅助提取法(UAE)、超临界流体提取法(SFE)等。MAE主要利用微波的能量在萃取过程中提高温度和压力，从而加快萃取速度，提高萃取效率，并且减少有机溶剂的用量[39]。由于萃取过程中温度的升高，MAE可能造成热不稳定性物质的分解。deMorais等[40]在人血浆样品的脂质提取中，比较了5种LLE方法与MAE法。结果显示，MAE与Folch法的脂质萃取总量相当，但用GC检测到的24种脂肪酸含量前者低于后者，说明MAE适合于定性而非定量分析。Pan等[41]以一种离子液体为溶剂，用MAE与传统LLE相比较，检测结果相近但萃取速度大大提高。这都说明在利用MAE萃取脂质时，需要根据待测物的性质进行条件优化，以期实现最佳的萃取效果。
UAE是利用超声波产生的机械振动、扩散等效应加速两相间物质传递，从而实现萃取的技术[42]。与MAE不同的是，UAE过程中不会升温，有利于热不稳定性物质的分析。此外，UAE可与LLE相结合，进一步提高样品中被分析物的萃取效率。Liu等[43]分析了超声对人血清样品的萃取及衍生过程的影响，结果表明，萃取及衍生过程均在超声条件下进行时，测得的脂肪酸信号增加了5%～60%。
超临界流体是指温度与压力均处于临界值以上的流体，具有低密度与高扩散性的特点，适合于样品的萃取或分离。SFE中最常用的超临界流体是CO2，其临界压力(7.4MPa)与温度(31℃)均较低，并且无毒害，易于去除。超临界CO2的极性与戊烷相近，适合于疏水性物质的萃取。用甲醇、二氯甲烷或水作为添加剂，SFE也可用于极性物质的萃取[44]。利用SFE的非破坏性，Deviese等[45]用反应曲面法优化出SFE的最佳条件，用于考古陶罐表面的脂质分析。与传统LLE相比，萃取效率得到提高，并且两种萃取方法得到的不饱和与饱和脂肪酸的比值不同。SFE作为一种新型的萃取分离技术，其萃取效率高，无污染，操作方便，适合于生物、食品、药物等样品的分析[46-48]。——论文作者：宋诗瑶，白 玉，刘虎威
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