发布时间：2021-09-28所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要：建立了测定硝苯地平中基因毒性杂质2、6和12的超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法(UHPLC-OrbitrapHRMS)。样品以甲醇为溶剂，提取后直接进样分析。采用ACEEXCELTM3C18-AR色谱柱(150mm4.6mm，3m)分离，流动相为甲醇-0.1%甲酸水(65∶35，v/v)，等度
摘要：建立了测定硝苯地平中基因毒性杂质2、6和12的超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法(UHPLC-OrbitrapHRMS)。样品以甲醇为溶剂，提取后直接进样分析。采用ACEEXCELTM3C18-AR色谱柱(150mm×4.6mm，3μm)分离，流动相为甲醇-0.1%甲酸水(65∶35，v/v)，等度洗脱。质谱部分采用电喷雾电离(ESI)源。采用正离子平行反应监测(PRM)扫描模式，质谱分辨率为35000FWHM，杂质2、6、12的[M+H]+母离子准确质量数分别为m/z347.1230、361.1026、347.1230，提取[M+H]+碎片离子准确质量数分别为m/z315.0968、298.1069、315.0968，归一化碰撞能量(NCE)分别为10%、42%、10%，外标法定量。对方法进行了详细的方法学验证，结果表明，该法专属性良好，溶剂对杂质测定无干扰;杂质2、6、12质量浓度与其峰面积在0.2～100ng/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数(r)均≥0.9998;杂质2、6、12在低、中、高3个水平下的回收率为96.9%～105.0%，RSD为1.21%～5.12%，检出限均为0.05ng/mL，定量限均为0.2ng/mL。应用该方法对3批硝苯地平样品中的杂质2、6、12进行测定，3批样品均未检出杂质6，但均检出杂质2和杂质12，其检出量未超过限度。该方法灵敏、快速、准确，操作简便，可为药企对硝苯地平的质量控制提供参考，并为药监部门的监管提供有力的技术支持。
关键词：超高效液相色谱;高分辨质谱;基因毒性;硝苯地平;杂质
二氢吡啶类钙拮抗剂是一类降压作用强、临床应用广、上市品种多的心血管疾病治疗药[1，2]，主要包括硝苯地平、氨氯地平、乐卡地平、尼莫地平、尼卡地平、尼群地平、非洛地平、拉西地平等在临床中常用的药物。硝苯地平是一种常见的第一代二氢吡啶类钙拮抗剂，可选择性地抑制钙离子进入心肌细胞和平滑肌细胞的跨膜转运，抑制钙离子从细胞内释放，且不改变血浆中钙离子浓度，对心血管平滑肌钙通道有阻滞作用，干扰肌肉的兴奋收缩，有较强的扩张血管作用，临床上主要用于高血压、心绞痛、心律失常及其他心血管疾病的治疗[3，4]。当前，对于硝苯地平杂质的研究主要集中在非致突变性杂质[5-10]，而对其基因毒性杂质的调查鲜有报道。硝苯地平杂质2、6、12的化学结构如图1所示，杂质2和杂质12含有的硝基基团、杂质6含有的氮杂芳基N-氧基团均属于基因毒性警示结构，应按照致突变性杂质的要求制定杂质限值[11]。
目前已报道的硝苯地平杂质的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[5，7，8]、超高效液相色谱法(UHPLC)[10]和液相色谱-质谱法(LC-MS)[6]。近年来，静电场轨道阱(Orbitrap)高分辨质谱技术凭借其超高质量精度、高灵敏度和高选择性的优势，在药品杂质分析方面的应用逐渐增多[12-15]。本研究建立了UHPLC-OrbitrapHRMS测定硝苯地平原料药中基因毒性杂质2、6和12的方法，并进行了详细的方法学验证。
1实验部分
1.1仪器、试剂与材料
ThermoQExactivePlusTM超高效液相色谱-高分辨质谱联用系统包括Ultimate3000三元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器以及Orbitrap高分辨质谱部分，Tune2.9软件用于质谱仪的调谐和质量轴的校正，XCaliburTM4.0软件用于设置仪器方法、编辑序列和处理数据，以上均购于Thermo公司(德国);MettlerXS205型电子天平(MettlerToledo公司，瑞士)用于精密称量。硝苯地平原料药由山东省某医药公司提供;杂质2对照品购自STD公司(美国)，批号为196132N-SL-01，纯度为98.7%;杂质6对照品购自QCC公司(美国)，批号为29-APR-19-32，纯度为99.98%;杂质12对照品购自STD公司(美国)，批号为1656312B-SL-01，纯度为99.6%;质谱级甲醇(纯度99.9%)、甲酸(纯度>99%)均购自Fisher公司(美国);实验用18.2MΩ·cm纯水由Milli-QAdvantageA10超纯水系统(Millipore公司，美国)制得。
1.2实验条件
1.2.1对照品溶液的制备
分别精密称取杂质2、6和12对照品10.07、10.20和10.26mg，分别以甲醇作为稀释剂，制成质量浓度分别为397.56、407.92和408.76μg/mL的对照品储备液。精密移取上述对照品储备液适量，加甲醇稀释得质量浓度约为20μg/mL的单一对照品溶液。精密移取20μg/mL各单一对照品溶液适量，加甲醇逐步稀释，得到质量浓度约为0.05、0.2、0.5、2、5、10、20、50、100ng/mL的杂质2、6、12混合对照品标准溶液。
1.2.2样品前处理
取硝苯地平约25mg，精密称定，置于50mL离心管中，精密加入甲醇25mL，涡旋使其完全溶解，摇匀即得。
1.2.3色谱条件
色谱柱为ACEEXCELTM3C18-AR柱(150mm×4.6mm，3μm)，柱温为35℃，自动进样器温度为8℃，流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(65∶35，v/v)，等度洗脱，流速为0.6mL/min，分析时间为18min，进样量为5μL，检测波长为235nm。
六通阀切换设置：保留时间为7.5～11.6min时，流动相进入废液，其余保留时间，流动相进入质谱检测。
1.2.4质谱条件
电喷雾电离源，正离子模式，喷雾电压3.5kV;毛细管温度350℃，辅助气加热器温度400℃;鞘气流量60arb，辅助气流量20arb。采用平行反应监测(PRM)质谱扫描模式，分辨率设为35000FWHM，隔离窗口(isolationwindow)设为m/z1.5，微扫描(microscans)设为3，自动增益控制(AGCtarget)设为2×105，最大离子注入时间(maximumIT)设为100ms。杂质2、6、12的具体质谱参数见表1。
2结果和讨论
2.1实验条件考察
2.1.1质谱条件优化
目前尚无硝苯地平杂质2、6、12的毒理学数据，可采用ICHM7R1推荐的毒理学关注阈值(TTC)来计算可接受摄入量，即单个杂质的可接受摄入量为1.5μg/d[16]。硝苯地平每日最大用量为80mg，故硝苯地平中杂质2、6、12限值的计算公式[11]为杂质限值=杂质可接受摄入量÷药物每日最大用量=18.75ng/mg。此限值比硝苯地平有关物质的限度(0.1%或0.2%)[11]低2个数量级，对仪器灵敏度要求较高，宜采用LC-MS进行测定。
本研究所使用的ThermoQExactivePlusTM超高效液相色谱-高分辨质谱联用系统的质谱部分串联了四极杆和Orbitrap两个质量分析器，拥有多样化的质谱扫描模式。在开发质谱方法时，考察了目标物选择性离子监测(TargetdSIM)、全扫描-数据依赖的二级扫描(FullMS/ddMS2)、PRM等不同的质谱扫描模式，结果发现在杂质2、6、12质量浓度≥10ng/mL时，3种扫描模式灵敏度相当，而当杂质2、6、12质量浓度低于10ng/mL时，在TargetdSIM或FullMS/ddMS2模式下采集的总离子流色谱图中无法提取杂质的色谱峰，但PRM模式下杂质2、6、12质量浓度为0.05～10ng/mL时依然能够获得较好的提取离子色谱图。因此，本研究采用PRM质谱扫描模式。采用Tune2.9软件优化杂质2、6、12的碰撞能量，选择合适的提取碎片离子，并对离子源气流速、温度、电压进行了精细调节和逐级优化，实现了杂质2、6、12的痕量检测，最佳质谱条件如1.2.4节所示，3种杂质的高分辨二级质谱图及碎片离子预测结构式如图2所示。
2.1.2色谱条件的优化在本研究中，杂质2和杂质12与硝苯地平为同分异构体，3者分子式、准确质量数、提取离子质量数均完全相同，因此杂质2、12及硝苯地平色谱峰必须达到基线分离才能够进行准确测定。另一方面，由于供试品溶液中含有高质量浓度的药品主成分硝苯地平(约1.0mg/mL)，如果高浓度硝苯地平进入质谱系统，会污染离子源并产生严重的基质效应，影响痕量杂质2、6、12的准确测定。因此，应充分优化色谱条件，尽可能提高杂质2、6、12与硝苯地平的色谱分离度，再通过在线六通阀将硝苯地平色谱峰切换到废液，避免高浓度硝苯地平进入质谱系统。实验考察了岛津Shim-packGISTTM苯基-己基柱(150mm×4.6mm，3μm)和ACEEXCELTM3C18-AR柱(150mm×4.6mm，3μm)等两种不同类型色谱柱的分离效果。当采用岛津Shim-packGISTTM苯基-己基柱时，杂质2与硝苯地平色谱峰保留时间相隔太近(<1min)，阀切换很难将硝苯地平主成分彻底切换，对其准确测定造成影响。采用ACEEXCELTM3C18-AR色谱柱(150mm×4.6mm，3μm)时，杂质6、硝苯地平、杂质2、杂质12的保留时间分别为6.25、10.74、14.26和15.91min。硝苯地平与3种杂质均实现了良好的色谱分离，通过六通阀控制将保留时间为7.5～11.6min时的流动相切入废液，有效避免了高浓度硝苯地平的基质干扰，保护了质谱离子源，降低了杂质2和杂质12的基线噪音，使杂质测定更加准确可靠。
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2.1.3样品前处理方法优化
中国药典载明：硝苯地平在丙酮或三氯甲烷中易溶，在乙醇中略溶，在水中几乎不溶[11]。然而，丙酮和三氯甲烷溶解性太强，会对液相色谱柱和液相色谱管路造成严重影响，同时也会使色谱图上出现一些干扰峰。此外，考虑到甲醇与流动相的兼容性明显优于乙醇。药典载明，硝苯地平以甲醇作为溶剂可配制成质量浓度为1mg/mL的溶液[11]。因此，综合以上考虑，本研究选用甲醇作为提取溶剂，硝苯地平样品含量定为1mg/mL。结果表明，硝苯地平与杂质2、6、12均能完全溶于甲醇，形成澄清透明的溶液，前处理简单。
2.2方法学考察
2.2.1专属性
将甲醇溶剂和杂质2、6、12混合对照品溶液分别进样测定，记录色谱图。甲醇溶剂的图谱如图3a所示，通过与对照品溶液提取离子色谱图(见图3b)对比可知，杂质2、6、12相同保留时间处无干扰峰存在，表明本方法专属性良好。
2.2.2线性范围
分别取0.2、0.5、2、5、10、20、50、100ng/mL的杂质2、6、12混合对照品溶液进样测定，以峰面积作为y、分析物质量浓度(ng/mL)作为x，不加权重拟合线性校正曲线，建立回归方程，计算相关系数(r)，如表2所示。结果表明，杂质2、6、12峰面积与其质量浓度分别在0.2～100ng/mL范围内呈现良好的线性关系，r均≥0.9998。
2.2.3检出限和定量限
精密量取质量浓度为0.2ng/mL的杂质2、6、12混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释，按照信噪比(S/N)≥3和≥10分别计算检出限和定量限。结果表明，3种杂质的检出限均为0.05ng/mL(即0.05ng/mg)，定量限均为0.20ng/mL(即0.20ng/mg)。3次定量限平行试验中杂质2、6、12的平均信噪比分别为23、21和17，峰面积RSD分别为5.4%、4.9%和6.0%。定量限提取离子色谱图如图4所示。
2.2.4回收率和精密度
取硝苯地平约25mg(批号1911231)，精密称取9份(低、中、高水平各3份)，先分别精密加入适量的杂质2、6、12混合对照品溶液，后续操作按照1.2.2节描述处理，得到加标回收试验用供试品溶液，进样测定。结果如表3所示，杂质2、6、12的加标回收率为96.9%～105.0%，RSD为1.21%～5.12%，符合药典规定，表明杂质2、6和12回收率和精密度良好。
2.2.5稳定性
将质量浓度约为0.20ng/mL的杂质2、6、12混合对照品溶液保存于进样瓶中，在自动进样器中按照实验条件放置0、8、12、24h后进样测定，杂质2、6、12峰面积的RSD值分别为4.3%、5.1%和4.5%，说明该条件下杂质2、6、12在24h内稳定性良好。
2.2.6耐用性
微调分析条件，将柱温分别调整为32℃和38℃、流速分别调整为0.55mL/min和0.65mL/min时，杂质的色谱峰形无变化，色谱保留时间和峰面积发生微小改变，各杂质峰面积和保留时间RSD值均<10%。因此，测定条件轻微变动不影响杂质2、6、12的检测，方法耐用性良好。
2.3实际样品检测
采用已验证的方法，对3批硝苯地平原料处理后，进样测定，外标法计算样品中杂质2、6、12含量，结果见表4，代表性提取离子色谱图如图5所示。3批样品均未检出杂质6，但均检出杂质2和杂质12，检出含量分别为0.315～0.382ng/mg和0.285～0.404ng/mg，远低于限度规定(18.75ng/mg)。因此，样品中杂质2、6、12的检出量符合规定。
3结论
本研究建立了硝苯地平中痕量基因毒性杂质2、6、12的UHPLC-OrbitrapHRMS检测方法，并进行了详尽的方法学验证。本方法灵敏度高，专属性好，回收率高，线性范围宽，填补了该领域的研究空白，可为药企对硝苯地平的质量控制提供参考，并为药监部门的监管提供有力的技术支持。——论文作者：郭常川1，谭会洁1，刘琦1，巩腾飞2，王雪1，王程霖1，3，徐玉文1*
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