发布时间：2014-06-14所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 论文摘要：临床研究显示，蠲痹颗粒能明显改善RA活动期的临床症状，降低C-反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子等实验室指标，有效率占82.5%。前期实验研究表明，蠲痹颗粒不仅具有明显的抗炎、免疫抑制作用，而且对大鼠佐剂性关节炎及小鼠胶原诱导性关节炎具有
论文摘要：临床研究显示，蠲痹颗粒能明显改善RA活动期的临床症状，降低C-反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子等实验室指标，有效率占82.5%。前期实验研究表明，蠲痹颗粒不仅具有明显的抗炎、免疫抑制作用，而且对大鼠佐剂性关节炎及小鼠胶原诱导性关节炎具有显著的治疗作用。
引言
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病。我国大陆地区的RA患病率为0.20%～0.40%[1]。在RA自然病程中，5～10年的致残率为60%，30年的致残率为90%，寿命缩短10～15年，而伴关节外表现者的5年生存率仅为50%[2]，极大地影响了患病人群的生活质量，开展干预RA研究对于人类健康具有战略性意义。滑膜炎被认为是RA发生发展的重要机制，因此深入研究其发病机制及可能的干预手段成为当前医学界治疗RA的热点问题。本研究旨在以温阳散寒除湿法组方的蠲痹颗粒为研究载体，探讨中医药干预RA关节病变进程的机制，为中医药干预炎症指标表达的机制提供理论和实验基础。
1 实验材料
1.1 实验动物 SPF级SD大鼠50只，雄性，8周
龄，体质量(180±20)g，购自简阳达硕动物科技有限公司，动物许可证号SCXK(川)：2008-24。饲养于云南省中医医院中心实验室SPF级动物房。实验前适应性喂养1周，自由摄水摄食。动物房温度维持在20 ℃，湿度维持在70%。
1.2 药品与试剂 牛Ⅱ型胶原(CⅡ)，购自sigma公司。完全弗氏佐剂(CFA)，购自美国BD公司。蠲痹颗粒(JB，主要由附片、川芎、赤芍、桂枝、麻黄、薏苡仁、五加皮等10余味中药组成)由本院药剂科提供。甲氨蝶呤片，上海信谊药厂有限公司生产(批号H31020644)。大鼠白细胞介素(IL)-1β Elisa试剂盒，购自欣博盛生物科技有限公司，实验操作步骤严格按说明书执行。
2 实验方法
2.1 动物分组 按随机数字表法将动物随机分为蠲痹低剂量组、中剂量组、高剂量组，甲氨蝶呤组，模型对照组及空白对照组(前4组每组10只，后2组每组5只)。
2.2 动物造模 除空白对照组外，其余大鼠均造模。实验前1天将牛Ⅱ型胶原溶于0.1 mol·L-1醋酸中，配制成总浓度为2 mg·mL-1的溶液，置于4 ℃冰箱过夜。冰浴下按照1∶1比例与CFA充分混匀，乳化，制成乳剂。以0.5 mL质量分数5%苯巴比妥麻醉大鼠，待麻醉后于距鼠尾根部2～3 cm
处注射，每只200 μL。
2.3 给药方法 致炎第21天起每日给药干预，蠲痹高、中、低剂量组分别以12.0 g·kg-1·d-1、
4.0 g·kg-1·d-1和2.0 g·kg-1·d-1蠲痹颗粒水溶液灌胃，甲氨蝶呤组每周1次给予甲氨蝶呤水溶液10 mg·kg-1
灌胃，模型对照组与空白对照组均给予生理盐水灌胃
10 mL·kg-1·d-1。实验期间均予SPF级普通饲料。分别于给药14 d和28 d(即实验第35天和第49天)各处死一半动物，活杀取血和滑膜组织备测。
2.4 关节炎症状评分 第1天初次免疫前开始，每隔7天采用关节炎指数(AI)评分法及足趾容积测量法评价关节炎病变的发生及严重程度。关节炎指数分为5级(0～4分)：0分，正常;1分，踝关节或腕关节轻度发红、肿胀，或明显的发红肿胀局限于足趾，不论受累数目;2分，踝关节或腕关节中度发红、肿胀;3分，踝关节或腕关节重度发红、肿胀;4分，多关节最大程度的炎症肿胀。最高可计4分。于AI评估同时，用足趾容积测量仪测量足爪炎症及肿胀程度。
2.5 取血方法及血清的制备 各组最后1次灌胃后开始禁食，第2天取血，采用腹主动脉采血法取血并处死动物;血液静置2 h后，置于3 000 r·min-1离心机，离心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存备用。
2.6 大鼠滑膜组织的收集 大鼠处死后，仰位固定，迅速离断四肢，剥离皮肤，用冷生理盐水冲洗干净后置于冰上操作;沿踝关节后方打开关节囊，可见有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织;用眼科直镊钝性分离关节囊的滑膜层和纤维层，完整剥离滑膜组织;最后以眼科镊轻轻夹住其中央，用眼科剪完整剪下滑膜组织，常规脱钙包埋，切片备用。
2.7 滑膜炎症评分 ①炎细胞浸润：0分，无炎细胞;1分，稀疏散在;2分，较密集;3分，大量。②纤维组织增生：0分，无纤维组织增生;1分，少量增生;2分，中量增生;3分，大量增生。③滑
膜细胞增生：0分，无滑膜细胞增生;1分，单层细胞肿胀密集;2分，两层细胞肿胀密集;3分，三层细胞肿胀密集。④巨噬样A型细胞增生：0分，无巨噬样A型细胞;1分，稀疏散在;2分，较密集;3分，大量。
2.8 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以进行统计描述，正态分布资料组间数据比较采用方差分析(ANOVA);偏态分布资料组间数据比较采用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 一般情况观察 实验期间，因炎症反应较重，共有4只大鼠死亡(低剂量组1只，高剂量组1只，甲氨蝶呤组2只)。空白对照组大鼠精神佳，毛色光泽，饮食正常。模型对照组大鼠易激惹，皮毛粗糙无光泽，瘦弱少食，体质量增长缓慢，部分大鼠行动困难。蠲痹低剂量组大鼠皮毛粗糙发黄，瘦弱懒动，蠲痹中、高剂量组和甲氨蝶呤组大鼠皮毛较光泽、精神可、饮食较好。
3.2 各组CIA大鼠35 d、49 d AI评分比较 35 d
时，蠲痹低剂量组、甲氨蝶呤组CIA大鼠AI评分比空白对照组显著增加，差异有统计学意义
(P < 0.05);其他组AI评分有增加趋势，但差异无统计学意义(P > 0.05)。49 d时，甲氨蝶呤组CIA大鼠AI评分比空白对照组显著增加，差异有统计学意义(P < 0.05);且蠲痹高剂量组在改善AI评分上明显优于甲氨蝶呤组(P < 0.05)。见表1。
表1 各组CIA大鼠35 d、49 d AI评分比较 分，
组别 35 d 49 d
蠲痹低剂量组 1.50±1.351) 1.00±1.41
蠲痹中剂量组 0.60±1.08 1.00±1.41
蠲痹高剂量组 0.50±1.23 0.50±1.002)
甲氨蝶呤组 1.60±1.271) 2.60±1.501)
模型对照组 1.20±1.64 1.50±2.12
空白对照组 0 02)
注 与空白对照组同期比较，1)P < 0.05;与甲氨蝶呤组同期比较，2)P < 0.05
3.3 各组CIA大鼠不同时间点足容积比较 35 d时，
蠲痹低剂量组CIA大鼠
趾容积比空白对照组显著增加，差异有统计学意义(P < 0.05)，其他组足趾容积有增加趋势，但差异无统计学意义;49 d时，各给药组与模型对照组比较，足趾容积有减小趋势，但差异无统计学意义(P > 0.05)。见表2。
表2 各组CIA大鼠不同时间点足容积比较 mL，
组别 0 d 35 d 49 d
蠲痹低剂量组 1.61±0.11 2.70±0.761) 2.42±0.67
蠲痹中剂量组 1.61±0.06 2.13±0.65 2.49±0.46
蠲痹高剂量组 1.58±0.08 2.08±0.73 1.91±0.45
甲氨蝶呤组 1.57±0.09 2.47±0.59 2.52±0.43
模型对照组 1.66±0.06 2.55±0.96 2.58±1.11
空白对照组 1.62±0.12 1.74±0.17 1.96±0.09
注 与空白对照组同期比较，1)P < 0.05
3.4 各组CIA大鼠35 d、49 d IL-1β比较 35 d时，
血清IL-1β水平，各组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.01);蠲痹高剂量组在改善血清IL-1β水平上优于甲氨蝶呤组(P < 0.05)。49 d时，各组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)，蠲痹中、高剂量组在改善血清IL-1β水平上明显优于甲氨蝶呤组(P < 0.01)。见图1、表3。
图1 大鼠血清IL-1β Elisa检测标准曲线
表3 各组CIA大鼠35 d、49 d IL-1β比较 Pg·mL-1，
组别 35 d 49 d
蠲痹低剂量组 131.50±34.171) 647.03±171.761)
蠲痹中剂量组 227.26±39.311) 284.74±30.111)3)
蠲痹高剂量组 42.19±41.641)2) 1 34.68±43.791)3)
甲氨蝶呤组 156.48±72.701) 668.19±104.991)
模型对照组 575.93±10.34 1 433.16±95.15
空白对照组 33.18±6.151)2) 23.08±1.381)3)
注 与模型对照组同期比较，1)P < 0.01;与甲氨蝶呤组同期比较，2)P < 0.05，3)P < 0.01
3.5 温阳散寒除湿法对CIA大鼠滑膜组织炎症的影响
3.5.1 CIA大鼠滑膜组织病理观察 见图2。
模型对照组(49 d) 空白对照组(49 d)
图2 大鼠滑膜组织病理光镜切片(HE染色×200)
3.5.2 各组CIA大鼠35 d、49 d滑膜组织炎症评分比较 CIA大鼠滑膜组织炎症评分，35 d时，各组与模型对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05);49 d时，蠲痹中剂量组在改善滑膜组织炎症评分上优于模型对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)，蠲痹高剂量组明显优于模型对照组，差异有统计学意义(P < 0.01)。见表4。 (下转第42页)
(上接第19页)
表4 各组CIA大鼠35 d、49 d滑膜组织炎症评分比较 分，
组别 35 d 49 d
蠲痹低剂量组 2.40±3.36 4.20±3.35
蠲痹中剂量组 5.00±2.92 3.60±2.071)
蠲痹高剂量组 1.60±1.95 2.40±1.672)
甲氨蝶呤组 3.60±2.41 4.80±2.78
模型对照组 5.00±2.00 8.00±0.00
空白对照组 0.50±0.71 0.33±0.582)3)
注 与模型对照组同期比较，1)P < 0.05;2)P < 0.01;与甲氨蝶呤组同期比较，3)P < 0.05
4 讨 论
蠲痹颗粒是著名中医学家吴佩衡学术继承人、云南省名老中医吴生元教授基于扶阳理论，总结出治疗RA的有效良方，具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治寒湿痹阻之RA。近6年来，蠲痹颗粒使用范围扩大到云南中医医疗集团54家医院近1 000例RA患者，显示了良好的临床疗效，且无明显毒副作用，倍受广大RA患者欢迎。
临床研究显示，蠲痹颗粒能明显改善RA活动期的临床症状，降低C-反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子等实验室指标，有效率占82.5%[3]。前期实验研究表明，蠲痹颗粒不仅具有明显的抗炎、免疫抑制作用，而且对大鼠佐剂性关节炎及小鼠胶原诱导性关节炎具有显著的治疗作用[4-6]。本次研究亦提示，蠲痹颗粒能对抗胶原诱导性关节炎大鼠的炎症病变进展，减轻滑膜炎症，其治疗作用可能与抑制相关炎症因子分泌、释放有关，相关作用机制有待进一步深入研究。
5 参考文献
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[2] 陈灏珠.实用内科学[M].12版.北京：人民卫生出社，2006：2548-2557.
[3] 彭江云，李兆福，刘维超，等.蠲痹颗粒治疗类风湿关节炎的临床疗效观察[J].中国中医风湿病学杂志，2009，30(12)：12-14.
[4] 彭江云，李兆福，杨洲，等.蠲痹颗粒抗炎镇痛作用的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志，2009，17(11)：52-53.
[5] 万春平，彭江云，李兆福，等.蠲痹颗粒对胶原诱导性小鼠关节炎的抑制作用及机制研究[J].中药材，2013，36(9)：1505-1507.
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