发布时间：2020-02-13所属分类：科技论文浏览：1次
摘 要： 摘要：建立温度、料液比、提取时间三个单因素系统，以吸光度为指标，确定三个最佳单因素条件，再经过多次实验建立响应面法水提多糖的模型，探究黄柏多糖的最佳提取工艺和研究其抗氧化能力。结果：确定最佳提取条件为3.0h，提取温度68℃，液料比30mL/g，在此
摘要：建立温度、料液比、提取时间三个单因素系统，以吸光度为指标，确定三个最佳单因素条件，再经过多次实验建立响应面法水提多糖的模型，探究黄柏多糖的最佳提取工艺和研究其抗氧化能力。结果：确定最佳提取条件为3.0h，提取温度68℃，液料比30mL/g，在此条件下，多糖的最高提取得率为77.3%。经过纯化可使黄柏多糖的含量达到80%以上。黄柏多糖对ABTS+清除能力较好。
关键词：黄柏;多糖;响应面法;抗氧化
1引言
黄柏(PhellodendronchinenseSchneid.)，为芸香科植物黄檗或黄皮树的干燥树皮。在我国中医用药历史上，黄柏是一种重要的常用中药材，其追根溯源可至《神农本草经》[1]，主要分布于东北三省、四川、云南、贵州、湖北和广西等地[2]。传统中医认为，黄柏能清热燥湿、泻火解毒、消肿祛腐，临床上可用于治疗黄疸、带下、热淋、痔漏，盗汗、遗精以及风疹瘙痒[3]。现代药理学认为，黄柏在抗肿瘤[4]、降血糖[5]、降血压[6]、增强免疫[7]、抗氧化[8]、抗溃疡[9]和抗痛风[10]等方面均有显著功效。根据研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗氧化和增强免疫力等生理活性。而多糖的这些生理活性与黄柏的药理作用有部分重合。近年来，关于黄柏的药理作用研究报道较多，植物来源虽不相同，但都证明黄柏有着良好的药理作用[11]。王海茹[12]等以黄柏花粉为研究对象，采用不同的除蛋白方法提取多糖，再对其抗氧化能力进行比较。甄铧[13]等采用超声波技术辅助提取多糖，并通过设计正交实验优化提取工艺。但目前少有研究通过响应面法优化黄柏多糖的提取工艺以及其抗氧化能力的测定，因此我们对黄柏多糖进行研究，这也将为黄柏药理作用的探索拓展新方向。
2材料与方法
2.1材料
黄柏粉末，苯酚(菏泽瑞晟化工有限公司);95%乙醇(河南拓邦化工有限公司);氯仿(贵阳新峰化工有限公司);正丁醇(武汉鑫中兴有限公司);葡萄糖(国药集团试剂有限公司);浓硫酸(国药集团试剂有限公司);七水合硫酸亚铁(武汉兴亚生物有限公司);四水合氯化亚铁(南京化学试剂有限公司);过硫酸钾(启东宏程化工有限公司);水杨酸(国药集团试剂有限公司);双氧水(郑州佳荣化工有限公司);菲啰嗪(上海君瑞生物有限公司);ABTS(酷尔化学科技有限公司);TRIS-HCL缓冲液(杭州联科生物有限公司)和邻苯三酚(南京化学试剂有限公司)等均为国产分析纯。
2.2仪器与设备
高速万能粉碎机ModelSF-2000(上海中药材器械公司);AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);HHS-2S电子恒温不锈钢水浴锅(上海光地仪器设备有限公司)、D2F-6020型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);高速离心机LG10-2.4A(上海精密实验设备有限公司);UV-240IPC紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。
2.3实验方法
2.3.1黄柏的预处理
将干燥后的黄柏药材放入粉碎机中粉碎，所得粉末过100目筛子，得到黄柏细粉[14]。
2.3.2样品溶液的制备、多糖的提取和黄柏多糖含量的检测
称取黄柏粉末20g，按照料液比1∶20的比例加入400mL体积分数为95%的乙醇，在70℃水浴2h后合并上清液。再利用大孔树脂除去多糖提取液的色素[15]，收集除去色素后的液体，然后浓缩直至150mL，再以等体积sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1)混合均匀后除去浓缩液中的蛋白质，得到多糖溶液，再加入4倍体积的95%乙醇，混合均匀，放入4℃环境内静置12h，离心，取下方沉淀的固体，放入真空干燥箱，在真空中干燥至无水分或含少量水分为止。运用苯酚―硫酸比色分光光度法测定其吸光度值并计算黄柏多糖得率。
2.3.3单因素试验
单因素实验采用控制变量法，研究不同的单因素X1(料液比)、X2(提取时间)和X3(提取温度)对黄柏多糖提取的影响，在单因素分析基础上，确定3个单因素的最适水平值，进行响应面优化试验。
2.3.4响应面优化试验
以吸光度为评价指标，考察X1(料液比)、X2(提取时间)和X3(提取温度)对黄柏多糖含量得影响，进一步通过Box-Expert的中心组合试验优化多糖含量的提取工艺。数据处理采用Design-Ex-pert8.0.6软件。
2.3.5抗氧化实验
通过研究黄柏多糖对Fe2+的还原能力和对ABTS+的清除能力，从而根据吸光度的差异可计算出其清除活性基团的清除率，而清除率的大小恰能反映出多糖抗氧化能力的强弱。
(1)还原能力测定：将多糖溶液配置成1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL的溶液，各自取500μL多糖溶液于试管，加入50μL氯化亚铁，100μL的菲啰嗪溶液，1.35mL的蒸馏水，充分反应，在波长为562nm处测定吸光度，此处吸光度为A1。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%，A0为对照组的吸光度(蒸馏水代替样品);A2为样品本底的吸光度(蒸馏水代替氯化亚铁溶液)。
(2)ABTS+清除能力测定：取配置好1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL的多糖溶液各400μL，加入1600μL的ABTS+，在室温下反应10min，于波长734nm处测定吸光度，此处吸光度为A1。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%，A0为对照组吸光度(蒸馏水代替样品);A2为样品本底吸光度(蒸馏水代替ABTS+储备液)。
3结果与分析
3.1黄柏多糖提取工艺条件单因素试验
结果和响应面优化实验 经过单因素实验，确定单因素的最佳条件分别为，料液比1∶30，提取时间3h，提取温度70℃时，在此条件下，吸光度为最大值。以吸光度为评价指标，考察X1(料液比)、X2(提取时间)和X3(提取温度)对黄柏多糖含量的影响，如表1所示。
表2数据可以构建出响应面模型：响应值为测得的吸光度的数值，三个因素为另外三个坐标轴，经过响应面软件的数据整合得出回归方程如下：Y=-0.43125+0.020918X1+0.11093X2+0.02107X3-0.0001X1X2-0.0000625X1X3-0.000025X2X3-0.000273X12-0.0173X22-0.0001405X32，对得到的结果作方差分析，结果如表3所示。
根据表3的数据，X3对响应面的作用极其显著，X2的作用为显著，X1X3的作用为高度显著，而且X12，X22，X32对响应面的作用都是极其显著，整个模型的P值也是小于0.001，作用为极其显著，实验的失拟项P值为0.35，作用为不显著，以上所有分析说明整个响应面系统的建立和实验优化条件是具备可行性的。判定系数R2为0.9917说明模型的建立很准确，模型校正判定系数RAdj2为0.9811，表示此模型可以预测和解释98.11%的实验数据，信噪比Adeqprecisior为26.072，证明此模型可以以用来预测实验结果。综上，响应面系统是准确的，可以用来预测和分析实验结果。
3.2响应面交互作用的分析
响应面三个单因素，可以产生三种两两交互作用的组合，分别是液料比和温度、液料比和时间、时间和温度。通过响应面软件可以绘出这三种交互组合的响应面分析图，借此可以非常清晰的看出响应面的交互影响，结果如图1―图3所示。
通过响应面优化提取黄柏多糖的提取条件，黄柏多糖的最佳提取条件为：料液比1∶30，提取温度68℃，提取时间3h。在此条件下，吸光度数值预测为0.7692，而五组平行验证实验所测得的吸光度数据分别为：0.759，0.769，0.773，0.762，0.767，五组数据的平均值为0.766。对平均值和预测值作结果分析，吻合度为99.58%，相对误差仅为0.42%，证明了模型的可靠性。
3.3抗氧化作用的分析
通过对黄柏多糖的还原能力和对ABTS+的清除能力进行分析后，结果如图4所示。
由图4可以看出，黄柏多糖具有一定的还原能力和对ABTS+的清除能力，且清除作用具有浓度依赖性。黄柏多糖的还原能力在4mg/mL时达到峰值，清除效果一般。黄柏多糖对ABTS+的清除率较高，并且在清除率的变化趋势上是随着多糖样品液的浓度升高而先增后减。多糖样品液浓度在4mg/mL时清除ABTS+的清除率达到最大峰值45.7%。
4结论
黄柏多糖的研究少有人涉及，本实验采取响应面法优化提取黄柏多糖，最后得出水提法提取黄柏多糖的最佳条件是：提取温度68℃、料液比1∶30、提取时间3h。在此条件下，吸光度数值预测为0.7692，验证实验的平均值为0.766，相对误差仅为0.42%，证明了模型的可靠性。研究得出黄柏多糖在一定浓度下具有还原能力，并且在浓度为4mg/mL时还原力最强。而黄柏多糖对ABTS+的清除效果较好，在浓度为4mg/mL时，其对ABTS+的清除效果最好，这可以为黄柏多糖的抗氧化研究提供理论基础。
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