发布时间：2020-03-21所属分类：科技论文浏览：1次
摘 要： 摘要：目的探索在药品对照品标化中色谱条件的影响因素。方法以2个待标化的对照品为例，采用HPLCDAD法对其纯度进行预标化。结果在HPLC中色谱柱类型、流动相的比例、柱温、流速、检测波长对其纯度检查均有一定的影响。结论色谱条件的影响因素较多，在实际应用
摘要：目的探索在药品对照品标化中色谱条件的影响因素。方法以2个待标化的对照品为例，采用HPLC—DAD法对其纯度进行预标化。结果在HPLC中色谱柱类型、流动相的比例、柱温、流速、检测波长对其纯度检查均有一定的影响。结论色谱条件的影响因素较多，在实际应用中可综合考虑。
关键词：纯度分析;对照品;高效液相色谱一二级管阵列检测
化学对照品是在结构、性质完全清楚的基础上，专供物理和化学测试时用于与供试药品进行对照的物质，其纯度适合于使用要求并且质量均一的实物样品[1]。在我国，对照品的精制及标化分装均由中国食品药品检定研究院(原中国药品生物制品检定所，简称中检所)承担。2010年，我所参与了部分新版药典用化学对照品的标化工作，除按《中国药典》2010年版对待标对照品进行纯度分析外，还需与美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典(BP)、日本药典(JP)等分析结果比较，分析各国药典方法的结果差异性。本文以2个对照品为例，探讨在对待标品进行纯度检查时色谱条件的影响因素。
1仪器与试药
Waters2690—996二极管阵列检测器，高效液相色谱系统(Waters公司)，AE-240电子天平(梅特勒公司)，ZF一1三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。乙酰谷酰胺对照品(批号：100859)、环扁桃酯对照品(批号：101118～201001)(中国食品药品检定研究院)。甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。
2《中国药典及其他各国药典收载分析方法情况
将2个对照品在《中国药典》及其他各国药典收载情况进行检索，分析方法收载情况见表1。
3对照品标化中对色谱峰的纯度要求
对照品标定作业指导书明确指出：尽量采用《中国药典》的液相或者气相方法进行纯度检查，如果国外药典的色谱系统与《中国药典》不一致，也需同时考察。HPLC法采用PDA检测器，采用面积归一化法和主成分自身对照法，供试品浓度的确定，以0.1浓度信噪比大于10为基础，对供试品溶液的主峰进行纯度检查，若不纯，对色谱条件进行调整直到纯度检查通过;可见色谱条件的优化程度直接关系到峰纯度。
“峰纯度”测试是将某个峰中的光谱与其峰顶点光谱进行比较，以确定该峰是否包含光谱不同的组分_2]。PDA可以获得样品的色谱图及每个色谱组分的光谱图，即提供三维光谱一色谱图(3D-谱图)。纯峰与不纯峰在Waters2690—996纯度识别见图1，纯峰与不纯峰的纯度角度及纯度阈值结果见表2。
4试验
4.1乙酰谷酰胺HPIC纯度标化过程的影响因素
4.1.1色谱柱的选择
在对乙酰谷酰胺对照品标定中，采用3种不同厂家的色谱柱：LichrospherC18柱(4.6mm×250mm，5/~m)(汉邦科技);XBridge州C18柱(4.6ramx250mm，5gin)(广州菲罗门);CapcellPAKC18柱(4.6mm×250mm，5/~m)(日本资生堂)。流动相：0.05mol·I2磷酸二氢钾溶液(用1o磷酸调节pH值至2.99)一甲醇(95：5)41;检测波长：210nm;进样体积：2OL;流速：1.0mL·min;柱温：3O℃;DAD扫描波长：190～800nm;供试品溶液的浓度：lmg·mI;对照品溶液的浓度：1p.g·mI～。乙酰谷酰胺在不同厂家色谱柱的色谱图见图2。
从图2可见LichrospherC18色谱柱(4.6ram×250mm，5/~m)(汉邦科技)峰形较好，但纯度未通过(纯度角度为4.532，纯度阈值为0.349)，因此选择LichrospherC18柱为该品种纯度测试的色谱柱。
4.1.2流动相比例的凋节
色谱峰的保留时间较短，将流动相适当调节，发现将有机相调节到1时，色谱峰的保留时间为5min左右，说明乙酰谷酰胺峰对甲醇的敏感度不高，且峰纯度未通过，可以从柱温、流速、进样量进行适量的调节。
4.1.3DAD扫描波长的选择
扫描波长时发现甲醇的基质影响较大，乙酰谷酰胺因为甲醇的截止波长为205nm，在设定DAD色谱峰纯度角度均是纯度阈值的10倍以上，纯度未通过。为消除该影响，笔者将DAD扫描波长设定为205～800nm。
4.1.4柱温、流速、进样量的选择
在试验中，将柱温适当降低，流速降低，色谱峰保留时间为llmin左右，峰纯度角度为0.498，而纯度阈值为0.358，纯度未通过;在保证0.1对照溶液主峰的信噪比为17.3时，将进样量调节至1oL，乙酰谷酰胺色谱峰纯度角度为0.268，纯度阈值为0.308，纯度通过。
可见，在使色谱峰纯度通过并满足0.1对照溶液的色谱峰的信噪比为1O的基础上，色谱柱类型、扫描波长范围、流动相组成成分比例的变化、柱温、流速、进样量的选择对色谱峰的纯度有一定的影响。
4.2环扁桃酯有关物质检测波长的选择
在对照品标化中，纯度测定方法选用色谱法，如HPLC检查采用二极管阵列检测器检测色谱峰纯度，TLC检查结果可作为HPLC检查结果的参考引。
环扁桃酯对照品标化HPLC纯度方法色谱条件：以CapcellPAKC18(4.6mm×250ram，5m)为色谱柱，乙腈一水(4：1)为流动相，检测波长为228nm(方法与USP32一NF27相同)。HPLC纯度检测结果采用面积归一化法，提取228nm的色谱图所得的供试品溶液中总杂质含量为0.20(为了检验数据的保密性，给出的数值是参考值)，其中最大杂质的含量为0.2(为了检验数据的保密性，给出的数值是参考值)。
环扁桃酯TLC法检查纯度薄层色谱条件：硅胶GF嘲板为薄层板，正己烷一乙酸乙酯一冰醋酸(8：2：1，v/V)为展开剂，在紫外光灯(254nm)下检视[6]。TIc纯度检测结果供试品显1个杂质斑点，其大小、颜色与4对照溶液相当(为了检验数据的保密性，给出的数值是参考值)。
杂质检测结果采用不同的色谱方法，结果差异比较大。分析原因：主要是杂质的检测波长的选择导致结果的差异性。在HPLC纯化中，将检测波长设定为254nm，采用面积归一化法，供试品溶液中总杂质含量为4.34(为了检验数据的保密性，给出的数值是参考值)，其中最大杂质的含量为4.1%(为了检验数据的保密性，给出的数值是参考值)，且该杂质在254nm的波长处有最大吸收。结果与TLC检测结果不谋而合。笔者提取228nm波长处环扁桃酯及杂质的吸收情况，根据其响应因子，确定228nm为环扁桃酯的有关物质的检测波长。可见检测波长的选择在HPLC有关物质检测中的重要性。
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5讨论
笔者在对乙酰谷酰胺HPLC纯度标化试验中发现：首先，色谱柱的类型、填料的性质及封尾情况对色谱峰的峰形有很大的影响;其次，考虑到溶剂的截止波长，调节DAD扫描波长范围;再次，考虑流动相的组成成分比例的变化、柱温、流速、进样量的选择。可见在色谱峰的纯度检测中影响因素较多，建议要综合考虑这些影响因素。
在HPLC法进行含量测定或者TLC鉴别时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。
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