发布时间：2019-11-28所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要: 仓储生态因子和烟叶化学成分的改变直接影响烟叶微生物群落结构和功能。以储存在贵阳库( GY) 、坛厂库( TC) 及紫云库( ZY) 的云南保山 C3F 烟叶为研究对象，对不同陈化时间( 0、6、12、18、24 个月) 的烟叶样品提取微生物总 DNA，利用 Illumina HiSeq
摘要: 仓储生态因子和烟叶化学成分的改变直接影响烟叶微生物群落结构和功能。以储存在贵阳库( GY) 、坛厂库( TC) 及紫云库( ZY) 的云南保山 C3F 烟叶为研究对象，对不同陈化时间( 0、6、12、18、24 个月) 的烟叶样品提取微生物总 DNA，利用 Illumina HiSeq 平台对细菌的 16S rRNA V4 区进行高通量测序，并结合主要化学成分分析，以期揭示烟叶陈化过程中细菌群落演替规律及其与烟叶化学成分间的作用关系。研究结果表明，烟叶细菌群落以假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、寡养单胞菌属、芽孢杆菌属为优势属; 随陈化时间的增加，细菌优势群落呈现出变形菌门和厚壁菌门间消长变化的趋势，陈化后期芽孢杆菌( 厚壁菌门) 优势度明显增强; 烟叶陈化过程中，细菌优势功能群变化与化学成分逐级降解间呈显著的相关关系，主要表现为由降解糖类菌群向降解淀粉类菌群，再向降解纤维素类菌群变化的趋势; 其中，影响菌群演替的关键因素是水溶性总糖和纤维素。研究结果揭示了在烟叶陈化过程中存在显著的细菌群落演替特征，加深了对烟叶陈化机制的理解，为微生物调控烟叶陈化过程提供了科学依据。
关键词: 高通量分析; 群落结构; 演替规律; 化学组分
烟叶陈化是指在人工可控的仓储环境下烟叶与微生物及环境相互作用的发酵过程，在此过程中，仓储环境因子( 温度、湿度等) 、烟叶化学组分( 总糖、蛋白质、淀粉、生物酶等) 含量、烟叶水分及酸碱度等与烟叶表面微生物彼此联系、互相促进、互相制约共同构成了烟叶陈化的特定生态系统，并在物质流、能量流和基因流 “三流运转”规律的交互作用下构成了烟叶微生态的动态发展和特定阶段的动态平衡[1]。环境信息的传递和烟叶化学物质的改变直接或间接的影响着烟叶微生物的种类和数量及代谢产物的产生与积累，并最终决定着物质和能量的走向[2-3]，因此，研究仓储生态因子和烟叶化学成分的改变对烟叶微生物群落结构和功能的影响具有重要意义。随着烟叶陈化的不断进行，微生物群落的消长演替又会引起烟叶组分微环境的变化[4]，如蛋白质、淀粉、糖类、纤维素等大分子物质降解[5-6]及紫罗兰酮、大马酮、糠醛等小分子物质产生[7-8]。环境因子变化也会作用于微生物，并导致群落结构及代谢产物的成分和比例发生变化，最终形成产品特有的生态风味[9]，所以，研究微生物群落动态变化对了解烟叶陈化生态系统的运行很有必要。
烟叶陈化过程中占优势的微生物群落以细菌类为主[10]，但是目前 90%—99%的微生物处于不可培养状态[11]，因此本研究依托二代测序的技术优势[12]对样品中微生物菌群进行分析，同时结合分析陈化过程中烟叶化学组分的变化，揭示细菌群落变化过程与烟叶化学组分之间作用规律，加深对烟叶陈化机制的理解。
1 材料与方法
1.1 材料
样品: 分别陈化了 0、6、12、18、24 个月的云南保山 C3F 烟叶样品( 产地: 云南保山地区; 品种: 云 87; 等级: C3F) ; 采集地: 贵阳库( GY) 、坛厂库( TC) 、紫云库( ZY) ; 采集方式: 除去烟箱表层烟叶，按五点式收集烟叶样品，500g，存于-20℃ 冰箱中，各库样品同一时间内采集; 采集时间: 2014 年 7 月、2015 年 1 月、2015 年 7 月、 2016 年 1 月、2016 年 7 月; 编号: GY-0、TC-0、ZY-0、GY-6、TC-6、ZY-6、GY-12、TC-12、ZY-12、GY-18、TC-18、ZY- 18、GY-24、TC-24、ZY-24。
1.2 方法
1.2.1 烟叶微生物收集与总 DNA 提取
参照 Zhao 等[13]和 Su 等[14]的网膜法收集烟叶总微生物。称取 60g 烟叶样品，剪碎，平均分成 3 份，分别置于 3 个装有 200mL pH = 7.0 磷酸缓冲溶液( PBS) 的三角瓶中，27℃、200r /min 震荡培养 1h; 用已灭菌的双层纱布过滤培养物，收集滤液; 6000r /min 室温离心 30min，收集沉淀; 加入 20mL PBS 缓冲液，重新制成菌悬液， 6000r /min 离心，收集沉淀，最后将相同样品的沉淀物汇集到一起，即为烟叶总微生物。参照 OMEGA 公司 E. Z.N.A. SoiL DNA Kit 试剂盒说明方法提取微生物总 DNA。提取的总 DNA 送北京诺和致源科技股份有限公司进行高通量测序。
1.2.2 PCR 扩增及高通量测序
选取 16S rRNA 基因 V4 片段进行 PCR 扩增，扩增产物使用 HiSeq2500 PE250 进行上机测序。选用引物: 515F( 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') 和 806R( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 。反应体系( 30μL) : Phusion Master Mix( 2×) 15μL; Primer1( 2μmol /L) 1.5μL; Primer2( 2μmol /L) 1.5μL; DNA 模板( 1ng /μL) 10μL; H2O 2μL。反应程序: 98℃预变性 1min; 98℃ 10s，50℃ 30s，72℃ 5min，共 30 个循环; 72℃延伸 5min。
1.2.3 化学物质检测
参照李永忠等[15]方法进行烟叶常规化学物质检测，每个样品设置 3 个重复。有机碳采用高温外热重铬酸钾氧化容量法; 全氮采用H2 SO4-H2O2消化-蒸馏法; 全磷采用 H2 SO4-H2O2消化-钼黄比色法; 全钾采用 H2 SO4-H2O2消化-火焰分光光度法; 水溶性总糖采用 80%酒精浸提-蒽酮比色法; 烟碱采用碱蒸馏-紫外分光光度法; 淀粉采用稀酸水解-蒽酮比色法; 蛋白质采用凯氏定氮法; 粗纤维采用酸碱洗涤-重量法; 石油醚浸提物采用石油醚浸提-重量法。
1.2.4 数据处理
①序列处理及 OTU 注释: 根据 Barcode 序列和 PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去 Barcode 和引物序列后使用 FLASH[16]对每个样品的 Reads 进行拼接，得到原始 Tags 数据; 参照 Qiime[17]的 Tags 质量控制流程，经过 Tags 截取、过滤及嵌合体去除等处理后得到高质量的有效 Tags 数据。利用 Uparse 软件，以 97%的一致性将序列聚类为 OTUs( Operational Taxonomic Units) ，选取 OTUs 的代表性序列用 Mothur 方法与 SSU rRNA 数据库对 OTUs 进行物种注释，并在 OTU 水平上进行 α 多样性分析。
②细菌群落动态变化分析: 通过韦恩图分析陈化不同时间的样品 OTUs 分布差异; 根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前 35 的类群，从物种和样品两个层面进行聚类，绘制成热图，分析不同陈化时间样品优势细菌类群变化情况; 通过 LEfSe 系统分析不同陈化时间的样品间显著差异的物种。
③细菌群落变化与化学成分关系分析: 结合不同陈化时间优势细菌及关键类群，利用 SPSS 19. 0、 CANOCO 5等统计学软件对细菌群落与各化学指标进行相关性分析和冗余分析( RDA) 。
2 结果与分析
2.1 高通量测序结果
Shannon-Winner 指数曲线可反映各样本的物种多样性随测序量的变化情况[18]。如图 1 所示，随着样品序列数的增加，Shannon-Winner 指数曲线越趋向平坦，表明本试验测序的数据深度能较全面地反应测序样品中微生物信息。
样品 DNA 高通量测序结果如表 1 所示，经拼接、优化、过 滤 后 得 到 1191887 条 有 效 序 列，每 个 样 品 得 67940—86235 条; 以 97%的一致性将序列聚类，平均得到 1099 个 OTU。对不同样品的 α 多样性指数进行对比分析发现，样品细菌丰富度的 Chao1 指数和 ACE 指数分别在 510. 34—3528. 94 和 520. 33—2226. 74 之间。反映菌 群 多 样 性 的 Shannon 和 Simpson 值 分 别 达 到 3.47—6.59 和 0.70—0.96。其中，样品 GY-0 细菌最丰富，多样性最大，Shannon 指数达 6.59，样品 ZY-18 多样性最低，Shannon 指数为 3.47; 样品 GY-24 和 TC-0 均匀性最好，Simpson 指数均达到 0.97，ZY-18 均匀性最差，Simpson 指数为 0.70。所有样品 Coverage 指数均达到 0.98以上，表明本次研究所测得的数据足够反应烟叶细菌群落的多样性。
2.2 细菌群落组成
烟叶细菌种类丰富，分属于 493 个属，每个样品相对丰度大于 1.0%的类群组成，如图 2 所示( < 1.0%的归于 Others) 。假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、寡养单胞菌属、芽孢杆菌属为主要优势类群，其中，假单胞菌属占主导优势，占 17.8%—44.3%，其次是鞘氨醇单胞菌属，占 8.0%—23.6%。
2.3 不同陈化时间烟叶细菌群落动态演替分析
2.3.1 OTU 变化分析
在 OTU 水平上绘制韦恩图，如图 3 所示。贵阳库( 图 3A) 样品有 313 个共有 OTUs，陈化 0、6、12、18、24 个月时分别有 267、110、90、120、159 个特有 OTUs。坛厂库( 图 3B) 样品有 170 个共有 OTUs，陈化 0、6、12、18、24 个月时分别有 249、82、126、115、262 个特有 OTUs。紫云库( 图 3C) 样品有 176 个共有 OTUs，陈化 0、6、12、18、 24 个月时分别有 192、97、140、41、264 个特有 OTUs。共有的 OTUs 表明这些细菌类群的作用在烟叶陈化过程中贯穿于陈化的始终，是烟叶陈化的主要细菌类群; 不同陈化阶段特有 OTUs 表明烟叶陈化过程中功能细菌群落与陈化进程密切相关，演替现象明显。
2.3.2 优势细菌类群变化分析
针对陈化不同时间对所有样品进行组合分析，发现烟叶细菌群落结构随陈化时间的延长发生了较大变化 ( 图 4 ) 。 陈化开始时拟杆菌门的 Sphingobacterium，变 形 菌 门 的 Steroidobacter、Aquicella、Legionella、 Pseudoxanthomonas、Methylobacterium 及 厚 壁 菌 门 的 Romboutsia 等 类 群 占 优 势。6 个月时变形菌门的 Pusillimonas 和 Vulgatibacter 占优势。12 个月时绿弯菌门的 unidentified_Anaerolineaceae 占优势。18 个月时，所有类群的丰度都相对较低，变形菌门的 Pusillimonas 占优势。24 个月时，变形菌门的 Stenotrophomonas 和 Comamonas，厚壁菌门的 Solibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Paenibacillus 及放线菌门的 Kocuria 等类群优势明显。
整体来看，随着烟叶陈化时间的增加，细菌优势类群种类先减少后增加，其中变形菌类逐渐减少，厚壁菌类和放线菌类逐渐增加，这种变化与李晓强研究结果相似[19]。
2.3.3 关键细菌类群变化分析
通过 LEfSe 分析( LDA 值默认为 4) 发现，在烟叶陈化 0、12、24 个月时样品之间具有显著差异的细菌类群，结果如图 5 所示。陈化开始时 Methylobacterium 差异显著，起重要作用。陈化 12 个月时 Enterobacteriaceae起重要作用。陈化 24 个月时 Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas 差异明显，发挥重要作用。 LEfSe 分析表明随烟叶陈化时间延长，关键优势菌群发生一系列演变，先 是 由 Methylobacterium 向 Enterobacteriaceae 演变，随后向 Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas 变化。其中，Methylobacterium、 Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas、Enterobacteriaceae 均属于变形菌门类群，Bacillus 属于厚壁菌门类群，因此，随陈化时间延长，厚壁菌门优势逐渐增加，芽孢杆菌优势度后期明显增强。
2.4 细菌群落演替与烟叶化学成分的关系
RDA 分析结果中，轴 1 和轴 2 累积变量分别为 50.70%和 73.24%，化学物质变化对细菌群落演替整体解释量为 78.90%。据图 6 和表 2 可知，水溶性总糖对细菌群落动态影响最大，其次是纤维素。陈化开始时 ( Ⅰ) ，水溶性总糖贡献最大，与 Pusillimonas 显著负相关，相关系数为- 0. 546，与 Steroidobacter、Romboutsia、 Clostridium_sensu_stricto_1、Legionella 显著正相关，相关系数分别为 0.613、0.613、0.656、0.517。陈化 12 个月时 ( Ⅱ) ，淀粉、石油醚浸提物及总氮、总磷等影响最大，石油醚浸提物与 Xanthomonas 呈显著负相关，相关系数为-0.541，与 Pusillimonas、Vulgatibacter 呈显著正相关，相关系数为 0.579、0.524; 总磷与 Xanthomonas 呈显著负相关，相关系数为-0.528。陈化 24 个月时( Ⅲ) ，纤维素作用最明显，与 Staphylococcus、Aureimonas、Massilia 呈显著正相关，相关系数为 0.562、0.539、0.528。随着时间的延长，细菌群落发生了由降解糖类向降解淀粉类菌群变化，再向降解纤维素类菌群变化的演替现象，这与化合物的逐级降解相关。
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