发布时间：2019-12-05所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要一氧化氮(NO)作为信号分子，在抵御重金属胁迫中起重要作用，但对不同离子胁迫下的解毒机制尚缺乏研究.本研究采用营养液培养法，研究了铜(Cu)、镉(Cd)单一或复合胁迫下，番茄幼苗对Cu、Cd的吸收转运特性及对外源NO的响应机制.结果表明:50molL-1的Cu2+、Cd
摘要一氧化氮(NO)作为信号分子，在抵御重金属胁迫中起重要作用，但对不同离子胁迫下的解毒机制尚缺乏研究.本研究采用营养液培养法，研究了铜(Cu)、镉(Cd)单一或复合胁迫下，番茄幼苗对Cu、Cd的吸收转运特性及对外源NO的响应机制.结果表明:50μmol·L-1的Cu2+、Cd2+均显著抑制番茄植株的生长，其中Cd胁迫对生长的抑制效应远高于Cu胁迫.Cu、Cd单一或复合胁迫均使番茄根系Cu、Cd含量显著升高，但根系对Cu、Cd吸收存在严格选择性.根细胞对必需元素Cu表现出“奢侈吸收”的现象，而对毒性较强的Cd则吸收相对较少，胞内Cd浓度仅为Cu的1/10左右.外源NO处理可不同程度地缓解Cu、Cd胁迫，其中缓解Cd胁迫的效能更强.番茄对被动进入细胞的Cu、Cd具有相似的解毒机制:一方面，Cu、Cd胁迫诱导细胞质中产生谷胱甘肽(GSH)、植物螯合肽(PCs)和金属硫蛋白(MTs)，络合过多的Cu、Cd离子，降低其生物毒性;另一方面，过多的Cu、Cd离子或螯合物被转运至液泡区隔化.外源NO通过调控GSH-GSSG(氧化型谷胱甘肽)氧化还原状态及GSH-PCs代谢方向的改变，促进Cu、Cd离子转运至液泡区隔化来缓解胁迫抑制;NO还可诱导植株叶片或根系表达更多的金属硫蛋白、GSH和PCs，而且上述响应普遍存在叠加效应.这可能是NO介导番茄对Cu、Cd胁迫的另一主要解毒途径.
关键词番茄;铜胁迫;镉胁迫;一氧化氮;谷胱甘肽;植物螯合肽
铜(Cu)是高等植物必需微量元素，同时也是重金属，过量Cu会对细胞产生毒害作用.Cu矿的开采和冶炼厂三废的排放、含Cu农业化学物质(杀菌剂、杀虫剂和化肥)和有机肥(高Cu猪粪、鸡粪和厩肥)的施用常使农田土壤，特别是温室土壤含Cu量达到一般农田土壤的几倍乃至几十倍[1-2].镉(Cd)是植物非必需元素，且是毒性最强的重金属，即使浓度极低也会对细胞产生毒害.这些重金属元素通常结合在生物大分子的活性位点，取代酶活性中心的金属离子，改变酶的活性，从而破坏其代谢功能[3].植物螯合肽(phytochelatin，PCs)是细胞中广泛存在的小分子多肽，富含半胱氨酸，其巯基可与细胞中的重金属离子形成螯合物，降低自由离子对细胞的生物毒性.PCs最早是从镉离子诱导的蛇根木(Rauvolfiaserpentina)悬浮细胞中提取到的镉结合多肽.PCs与源于动物的金属硫蛋白(metallothioneins，MTs)(同样富含半胱氨酸)的差异在于PCs不是基因的产物，而是以谷胱甘肽(glutathione，GSH)为前体催化合成.GSH在重金属毒害中具有双重作用，既是一种重要的抗氧化剂，又是PCs合成的直接前体，而PCs清除H2O2的能力是GSH的5～6倍[4].这些螯合剂通常存在于细胞质中，是植物应对重金属胁迫的重要机制.
土壤重金属元素有Cd、Cu、Hg、As、Cr、Pb等，离子种类对不同螯合剂的诱导程度存在很大差异.Cu2+、Cd2+均带有二价正电荷，虽然不是伴生金属，但二者均是土壤中最为常见的污染元素.污染土壤中的金属离子常以复合胁迫的形式存在，其相互作用(表现为拮抗效应、叠加效应或协同效应)直接影响植物对金属离子的累积和不同层次上的生物毒性[5]，这种互作在理化性质相似的离子之间更为显著[6].一氧化氮(NO)作为一种信号分子，参与多种重金属胁迫的响应机制，在植物重金属解毒机制中起重要作用[7-8].番茄(Solanumlycopersicum)是广受人们喜爱的蔬菜，在城市郊区及设施栽培等重金属污染较重的区域普遍栽培.本研究以番茄为试验材料，采用营养液培养，探索外源NO缓解番茄Cu、Cd胁迫的机制，为揭示Cu、Cd互作及复合重金属胁迫的解毒机理提供理论依据.
1材料与方法
1.1供试材料
供试番茄品种为“改良毛粉802F1”，购自登海五岳泰山种业有限公司.Hoagland改良营养液组成为Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、EDTA-Na、微量元素，以上试剂均为分析纯，用蒸馏水配置.NO供体为硝普钠([Na2Fe(CN)5]NO，SNP)，购自Sigma公司，Cu2+、Cd2+分别由CuCl2、CdCl2提供，先用蒸馏水配成200μmol·L-1的母液，4℃避光保存，用时按所需浓度稀释.
1.2试验设计
试验在山东农业大学智能温室栽培床上实施，种子经55℃温汤浸种消毒15min，然后在润湿的吸水纸上28℃催芽.待种子露白后，播于洗净的细砂中，于育苗盘中培养，出苗后用1/4Hoagland改良营养液浇灌.当幼苗长出3～4片真叶时，挑选生长一致的植株洗净根部细砂，移栽于盛有1/2Hoagland改良营养液的塑料桶(5.0L)培养，每桶定植5株.预培养1周，换成完全营养液.每3d更换1次营养液，低浓度KOH或HCl调节pH至(5±0.2).营养液培养期间用电动气泵24h连续通气.
当植株长至5～6片真叶时，对番茄幼苗进行胁迫处理.试验设置7个处理:1)完全营养液(对照，CK);2)50μmol·L-1CuCl2，Cu胁迫处理(Cu);3)50μmol·L-1CuCl2+100μmol·L-1SNP，NO缓解处理(Cu+S);4)50μmol·L-1CdCl2，Cd胁迫处理(Cd);5)50μmol·L-1CdCl2+100μmol·L-1SNP，NO缓解处理(Cd+S);6)50μmol·L-1CuCl2+50μmol·L-1CdCl2，Cu和Cd胁迫处理(Cu+Cd);7)50μmol·L-1CuCl2+50μmol·L-1CdCl2+200μmol·L-1SNP，NO缓解处理(Cu+Cd+S).每处理重复3次，随机排列.处理8d后收获植株根系及叶片.部分鲜样用于测定酶活性，部分样品液氮速冻，-80℃贮存备用.
1.3测定项目与方法
1.3.1植物亚细胞组的分离及各亚细胞组分Cu、Cd含量测定采用离心法对番茄根系亚细胞组分(细胞壁、细胞器及细胞可溶性组分)进行分离[9].并将分离的各组分分别转移至三角瓶，电热板蒸干，再加入5mL浓硝酸消煮，50mL容量瓶定容，原子吸收分光光度计(岛津AA3700)测定Cu、Cd.
1.3.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(GS)活性测定γ-ECS活性采用试剂盒(购自南京建成)测定;GS活性采用试剂盒(购自江莱生物)测定.
1.3.3植物螯合肽、谷胱甘肽及金属硫蛋白(MTs)含量测定PCs测定采用差减法[10]，公式为:PCs=(TNP-SH)-(GSH-GSSG).非蛋白质态巯基总量(TNP-SH)含量测定利用Ellman试剂进行定量[11].还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定参照郝建军等[12]的方法;MT含量测定采用银饱和分析法[13].
1.4数据处理采用MicrosoftExcel软件对数据进行处理及绘图，采用DPS统计软件的Duncan极差法对平均数进行多重比较(α=0.05).
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2结果与分析
2.1外源NO对不同Cu、Cd胁迫下番茄幼苗生长的影响由表1可知，50μmol·L-1Cu、Cd单一胁迫和复合胁迫均使番茄生物量显著降低，其中Cd的毒害效应显著高于Cu.与对照相比，Cd处理下番茄地上部和根系的生物量降幅均最大(分别为50.3%、48.1%).Cu+Cd复合胁迫下，番茄地上部与根系生物量分别比对照降低30.8%和18.7%，但与单一胁迫相比，复合胁迫地上部生物量较Cu单一胁迫降低13.4%，较Cd单一胁迫反而增加28.2%，差异显著.外源NO对Cd单一胁迫下番茄地上部和根系生表1外源NO对不同Cu、Cd胁迫下番茄幼苗生长的影响Table1EffectsofexogenousNOonthegrowthoftomatoseedlingsunderdifferentCu，Cdstress处理Treatment地上部鲜质量Shootfreshmass(g·plant-1)根系鲜质量Rootfreshmass(g·plant-1)株高Shootheight(cm·plant-1)CK32.52±0.76a9.53±0.71a35.70±0.41aCu25.97±0.28b6.95±1.57b33.30±0.23aCu+SNP29.80±0.23a7.70±0.77b34.47±0.54aCd16.15±0.44d4.95±0.67c12.00±0.95bCd+SNP21.40±0.12c7.25±0.46b36.43±0.55aCu+Cd22.50±0.47c6.85±0.45b29.58±0.81aCu+Cd+SNP20.10±0.032c7.82±0.52b31.23±0.57a不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)Differentsmalllettersmeantsignificantdifferenceamongtreatmentsat0.05level.下同Thesamebelow.物量的抑制缓解效应最显著，而对Cu单一胁迫和Cu+Cd复合胁迫下番茄地上部和根系生物量的抑制缓解效应不明显.与对照相比，不同Cu、Cd胁迫处理均降低番茄株高，其中Cd单一胁迫处理降幅最显著(达67.1%).外源NO一定程度上可缓解Cu、Cd胁迫对番茄茎伸长的抑制作用，Cd单一胁迫下添加NO番茄株高恢复最为明显(为Cd胁迫的3倍)，株高甚至超过对照.而Cu单一胁迫和Cu+Cd复合胁迫下添加外源NO对株高的影响均不显著.
2.2外源NO对Cu、Cd胁迫下番茄根系Cu、Cd亚细胞分布的影响
由表2可知，正常营养条件下，Cu较为均匀地分布在根系亚细胞的各个组分.与对照相比，Cu单一胁迫和Cu+Cd复合胁迫下细胞壁、细胞器、可溶性组分Cu含量均显著增加.Cu单一胁迫下各部位Cu含量分别为对照的5.53、2.75和9.35倍，而复合胁迫下各部位含量分别为对照的4.64、6.25和10.33倍.可见，进入细胞的Cu呈急剧增加的趋势，尤其是各细胞器组分的增幅最大.不同Cu、Cd胁迫处理下，可溶性组分的Cu浓度均最高.添加外源NO后，Cu单一胁迫下的番茄根系细胞器和可溶性部分Cu含量分别下降33.3%和9.3%，差异显著，但未恢复至对照水平;Cd单一胁迫下各亚细胞组分亦不同程度降低，细胞器中Cu降幅最大(75.2%)，其次是细胞壁(31.9%);Cu+Cd复合胁迫下添加外源NO使细胞壁和可溶性部分Cu含量继续升高，而细胞器中则降低8.6%.
与对照相比，Cd单一胁迫处理的细胞壁和细胞器中Cu含量分别降低12.2%和3.1%，可溶性部分有增加的趋势(5.9%)，说明正常营养条件下添加过量Cd2+，可部分取代细胞器及组织上的结合位点，促进有限的Cu2+转向可溶性组分，但差异并不显著.Cd单一胁迫和Cu+Cd复合胁迫下，过多的Cd更多分布于细胞可溶性组分，Cu+Cd复合胁迫下，细胞器和可溶性组分Cd含量比Cd单一胁迫高出84.9%和37.2%，表明Cd胁迫下添加Cu有促进Cd吸收的趋势.添加外源NO后，Cd单一胁迫亚细胞各组分Cd含量继续升高，细胞壁、细胞器和可溶性组分分别升高27.3%、38.5%和57.9%.Cu+Cd复合胁迫处理在添加外源NO后各部位Cd含量亦有升高的趋势，但只有可溶性组分增幅显著(达22.3%)
以上分析显示，外源NO对Cd胁迫下Cu、Cd吸收的调控幅度普遍大于Cu胁迫.无论是Cu单一胁迫还是Cd单一胁迫，外源NO对Cu的吸收呈现抑制的趋势;不管是Cd单一胁迫还是Cu+Cd复合胁迫，外源NO对Cd的吸收呈现促进的趋势.
2.3外源NO对Cu、Cd胁迫下番茄γ-ECS和GS活性的影响
由图1可知，不同Cu、Cd胁迫处理在一定程度上可使番茄根系和叶片γ-ECS活性显著提高，且Cu和Cd单一胁迫下叶片的γ-ECS活性普遍高于根系.与对照相比，Cu+Cd复合胁迫下根系γ-ECS活性达到最高，比Cu、Cd单一胁迫分别提高120.1%和41.5%;叶片中γ-ECS活性的变化趋势与根系相反，复合胁迫分别比Cu、Cd单一胁迫降低8.3%和24.4%.无论根系还是叶片，Cu单一胁迫在添加外源NO后，γ-ECS活性均显著提高(分别恢复65.6%和12.6%).Cu+Cd复合胁迫下添加外源NO后γ-ECS活性的变化趋势与Cd单一胁迫相近，根系和叶片γ-ECS活性分别降低12.1%和28.5%.
与对照相比，不同Cu、Cd胁迫处理均显著提高番茄GS活性，其中Cu+Cd复合胁迫比Cu、Cd单一胁迫GS活性高，根系和叶片分别比对照提高57.6%和65.1%，比Cu单一胁迫提高39.5%和42.2%，比Cd单一胁迫提高40.5%和68.4%.添加外源NO对不同Cu、Cd单一胁迫和复合胁迫下GS活性均有促进作用，其中根系GS活性增幅较大，分别比未施NO处理增加73.1%、59.3%和45.4%.
2.4外源NO对Cu、Cd胁迫下番茄GSH和GSSG含量及GSH/GSSG的影响
由图2可以看出，番茄根系中，Cd单一胁迫下GSH含量比对照提高10.8%，而Cu单一胁迫和Cu+Cd复合胁迫下，GSH含量分别降低12.6%和37.9%，差异显著.添加外源NO对根系Cu、Cd单一胁迫下的GSH含量影响不显著，但显著提高复合胁迫下根系GSH含量(提高80%).叶片中，Cu单一胁迫GSH含量大幅下降，Cd单一胁迫和Cu+Cd复合胁迫GSH含量无显著变化，但添加外源NO后，Cu、Cd单一胁迫叶片GSH含量急剧上升，分别增至胁迫处理的3.0和1.5倍，超出了对照.而Cu+Cd复合胁迫下添加外源NO后，叶片GSH含量则减少至原来的54.3%，与根系GSH含量骤升的趋势相反.
与对照相比，根系中，Cu单一胁迫下GSSG含量显著上升，添加NO后GSSG含量反而下降.Cd单一胁迫下，番茄GSSG含量有所降低，添加NO后有所回升，但差异均不显著;与对照相比，Cu+Cd复合胁迫GSSG显著降低，添加外源NO后继续下降;叶片中，Cu单一胁迫的GSSG升高至对照的2.1倍，添加外源NO后GSSG含量回落至对照水平.Cd单一胁迫下，叶片GSSG含量有所降低，添加外源NO后显著回升，甚至高于对照，而Cu+Cd复合胁迫下添加外源NO后叶片GSSG含量亦显著回升(增加86.9%).根系和叶片GSSG、GSH含量变化对NO的响应呈现互为消长的趋势，说明Cu、Cd胁迫诱导GSH/GSSG的氧化还原过程.
SCISSCIAHCI
