发布时间：2020-01-07所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要:目的建立UPLC波长变换测定地榆中没食子酸和鞣花酸的方法，并对游离和水解样品中的成分进行分析。方法采用UPLC法，色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm50mm，1.7m)，流动相为乙腈-0.1%磷酸，进行梯度洗脱。结果没食子酸和鞣花酸的平均回收率分别为97.9%和
摘要:目的建立UPLC波长变换测定地榆中没食子酸和鞣花酸的方法，并对游离和水解样品中的成分进行分析。方法采用UPLC法，色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸，进行梯度洗脱。结果没食子酸和鞣花酸的平均回收率分别为97.9%和99.8%，RSD分别2.1%和1.6%(n=6)。结论所建立的方法稳定、准确、可靠，游离没食子酸和鞣花酸更适合作为地榆饮片的质量控制指标。
关键词:地榆;没食子酸;鞣花酸;超高效液相色谱
地榆为蔷薇科植物地榆SanguisorbaofficnalisL.或长叶地榆SanguisorbaofficinalisL.var.longifolia(Bert.)YuetLi的干燥根[1]。地榆始载于《神农本草经》，列为中品，其味苦、酸、涩，性微寒。归肝、大肠经。具有凉血止血，解毒敛疮的功效，用于治疗便血，痔血，血痢，崩漏，水火烫伤，痈肿疮毒等[1，2]。地榆主要化学成分为鞣质和三萜类化合物，此外还有黄酮类、蒽醌类化合物[3，4]。
一般认为鞣质是地榆止血作用的主要活性成分[5]，但是实验表明口服给予实验动物大分子的单宁酸，止血作用较差;而没食子酸和鞣花酸具有较好的止血活性[6，7]，故小分子的鞣质类成分是与其止血功效密切相关的物质基础。因此建立地榆中游离没食子酸和鞣花酸的含量测定方法，为优选更合理的地榆质控指标提供依据。
1仪器与试药
1.1仪器WatersH-classUPLC全自动高效液相色谱仪(含PDA检测器);XS205D1/10万电子天平(梅特勒托利多);LC-350A型超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂)。
1.2试药没食子酸对照品(批号:110831-201302)购自中国药品生物制品检定所、鞣花酸对照品(批号10149850)购于美国阿法埃莎(AlfaAesar);乙腈(色谱纯)购于美国默克，磷酸(色谱纯)购于天津科密欧化学试剂有限公司，甲醇(分析纯)购于天津富宇精细化工有限公司。屈臣氏蒸馏水。
药材:市售地榆饮片，经本院中药资源研究室林慧彬研究员鉴定为蔷薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.的干燥根。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱(1.7μm，2.1mm×50mm);流动相:A乙腈，B为0.1%磷酸水(0～0.7min，A1.5%→4%;0.7～1.7min，A4%→30%;1.7～3.5min，A30%→40%，3.5～5min，A40%→50%)。流速:0.6ml·min-1;柱温35℃。波长:270nm/252nm。进样量:0.5μl。在上述色谱条件下，没食子酸、鞣花酸对照品和供试品的色谱图见图1、图2。
2.2溶液制备
2.2.1对照品溶液的制备分别精密称取没食子酸、鞣花酸对照品适量，加甲醇溶解，制成每毫升含没食子酸0.10mg，鞣花酸0.45mg的溶液，即得。
2.2.2供试品溶液的制备称取地榆粉末(过4号筛)约0.2g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理40min，放凉，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
2.3线性关系考察分别吸取不同体积的没食子酸对照品溶液，注入高效液相色谱中，测定，以对照品进样质量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制出校正曲线，Y=5078154X-2979.6，相关系数R2=0.9999。结果表明，没食子酸进样量在0.0198～0.2376μg范围内具有良好的线性关系。
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分别吸取不同体积鞣花酸对照品溶液，注入高效液相色谱中，测定，以对照品进样质量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制出校正曲线，Y=9175392X+9142.6，相关系数R2=0.9997。结果表明，鞣花酸进样量在0.0123～0.1848μg范围内具有良好的线性关系。
2.4精密度试验按“2.1”项下色谱条件，将没食子酸和鞣花酸对照品溶液重复进样6次，每次0.5μl，测定没食子酸的峰面积RSD为0.77%，鞣花酸的峰面积RSD为0.39%，表明精密度良好。
2.5稳定性试验按“2.1”项下色谱条件，取供试品溶液，室温条件下，分别在0，2，4，6，8，10，12，24h进样并进行分析，测定峰面积。结果没食子酸在24h内峰面积RSD为0.92%，鞣花酸在24h内峰面积RSD为0.84%，表明该供试品溶液至少在24h内稳定。
2.6重复性试验精密称取同一批次的地榆样品粉末6份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件精密吸取一定量的样品溶液注入液相色谱仪，依法测定，计算没食子酸和鞣花酸含量。结果没食子酸和鞣花酸的含量分别为0.66%和0.89%，RSD分别为2.22%和2.17%，表明方法重复性良好。
2.7加样回收率精密称取已知含量的地榆样品6份，分别加入没食子酸和鞣花酸对照品溶液适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，计算没食子酸和鞣花酸的平均加样回收率，结果见表1，表2。
2.8样品测定称取地榆样品粉末，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积并计算各样品中游离没食子酸和鞣花酸的含量，见表3。
称取地榆样品粉末，按照《中国药典》2015年版地榆项下没食子酸含量测定方法，制备药典法供试品溶液，按照，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积并计算各样品中水解没食子酸和鞣花酸的含量，见表3。
10批不同产地地榆饮片中，没食子酸含量在0.07%～0.96%之间，鞣花酸含量在0.36%～1.28%之间;水解后没食子酸含量在0.39%～4.65%之间，鞣花酸含量在0.09%～0.49%之间。
3结论
《中国药典》2015年版地榆项下收载了没食子酸的含量测定，其提取方法是以10%的盐酸水解3h后，测定其水解产物中的没食子酸含量，而本文所采用的提取方法是甲醇超声提取，具有用时短，操作简便的优点。由测定结果可知，药典法制备的样品中没食子酸含量高于本文所建立的方法，原因是地榆中含有大量没食子鞣质，在盐酸的作用下，发生水解成了没食子酸，使其含量升高;同时鞣花酸含量却显著降低，原因是鞣花酸的结构中含有酯键，在酸水加热的条件下发生水解从而引起结构的变化。
采用UPLC法测定地榆中的没食子酸和鞣花酸，最短可在3.5min内完成一次测定，大大节约了时间;通过波长变换的方法，可分别在没食子酸和鞣花酸的最大吸收波长270nm和252nm进行测定，提高测定的准确度。
采用SPSS软件对两组数据进行正态分布检验，K-S结果sig.=0.2>0.05，均服从正态分布。10批不同产地地榆饮片游离没食子酸平均含量为0.457%±0.298%，鞣花酸平均含量为0.763%±0.356%，离散度均较大，不同产地地榆游离没食子酸含量相差极大，最高者是最低者的10倍以上，而鞣花酸含量相差3倍左右，表明各地产的地榆质量有较大差异。
一般认为鞣质是地榆止血作用的主要活性成分[5]，但是实验表明口服给予实验动物大分子的单宁酸，止血作用较差;而没食子酸和鞣花酸具有较好的止血活性[6，7]，故小分子的鞣质类成分是与其止血功效密切相关的物质基础。因此建立地榆中游离没食子酸和鞣花酸的含量测定方法，制定合理的含量限度对于提升地榆质控指标具有重要意义。将地榆饮片游离没食子酸和鞣花酸平均值下浮20%，分别为0.366%和0.610%，若作为其含量限度，10批地榆饮片中，2号、6号、7号、8号共四批样品含量低于没食子酸限度，2号、5号、6号、7号、8号共五批样品地榆鞣花酸限度，因此在进一步实验中，应扩大样品量，为制定更合理的地榆质控标准提供数据支撑。
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