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高效液相色谱法测定小叶女贞果实中山柰酚的含量

发布时间:2020-01-09所属分类:农业论文浏览:1190次

摘 要: [摘要]目的:研究小叶女贞果实中山柰酚的酸水解提取条件,建立高效液相色谱法测定小叶女贞果实中的山柰酚含量的方法,并分析不同来源药材中山柰酚的含量差异。方法:小叶女贞果实经体积分数为20%的盐酸-甲醇溶液(1:4)水解提取后,用高效液相色谱法测定其水

  [摘要]目的:研究小叶女贞果实中山柰酚的酸水解提取条件,建立高效液相色谱法测定小叶女贞果实中的山柰酚含量的方法,并分析不同来源药材中山柰酚的含量差异。方法:小叶女贞果实经体积分数为20%的盐酸-甲醇溶液(1:4)水解提取后,用高效液相色谱法测定其水解液中的山柰酚的含量。以InertsilODS-SP(5μm,250×4.6mm)色谱柱,乙腈-0.3%磷酸水溶液(37:63)为流动相进行等度洗脱,流速为1.000ml/min,检测波长为370nm;柱温为35℃。结果:实验的方法学考察结果表明,山柰酚进样量在0.192~1.152μg范围内的峰面积与吸光度有良好线性关系,其回归方程为y=5E+06x+18.723,r=0.9998;平均回收率为98.64%(RSD%=1.89,n=6);在此测定条件下稳定性试验的RSD为1.52%,样品溶液在24h内稳定,重复性试验的RSD为1.42%,该测定方法的重现性较好;9批不同来源小叶女贞果实样品中山柰酚含量有一定差异,平均含量为0.3506mg/g,RSD为0.18%。结论:酸水解提取-高效液相色谱法可用于小叶女贞果实中山柰酚的含量测定。

高效液相色谱法测定小叶女贞果实中山柰酚的含量

  [关键词]高效液相色谱法;小叶女贞果实;山柰酚;含量测定

  小叶女贞(LigustrumquihoniCarr.)又名小叶冬青,在全国各地均有分布,资源丰富。其根叶可入药,具有清热解毒的功效,可治疗外伤、烫伤等症。经文献检索和资料查阅,该植物果实的药用未发现有文献记载。据文献报道小叶女贞中含有齐墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚及挥发油等化合物;其提取物具有免疫调节、止咳平喘及清除自由基的作用;山柰酚的抗菌、抗病毒、抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、对动脉粥样硬化及糖尿病的防治作用备受关注。小叶女贞果实中山柰酚至今尚未见有含量测定的报道。本实验建立了HPLC测定小叶女贞果实中山柰酚的方法,该方法简便易行、结果准确、重复性好。

  1 实验材料

  1.1 仪器

  LC-20A色谱仪(岛津),SPD-M20A二极管阵列检测器(岛津);MS105型分析天平(梅特勒-托得多仪器有限公司);K-Q500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TG16-WS台式高速离心机(郑州宏朗仪器设备有限公司);DZKW-4电子恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂)。

  1.2 药品及试剂

  山柰酚对照品(批号为ST0105,上海如吉生物科技);乙腈为色谱纯(德国默克公司),其余所用试剂均为分析纯。

  1.3 药材

  药材9批,于冬至前采集,经天然药物教研室陆鸿奎副教授鉴定为木犀科女贞属植物小叶女贞(LigustrumquihoniCarr.)的果实。

  2 方法与结果

  2.1 对照品溶液的制备

  取山柰酚对照品适量,精密称定,用甲醇溶解制成每1ml含山柰酚0.0960mg的对照品溶液,即得。

  2.2 供试品溶液制备

  取药材样品粗粉(过2号筛)1g,精密称定,用石油醚50ml回流1小时,药渣挥干石油醚后,加入20%盐酸溶液15ml,乙酸乙酯60ml水浴回流提取1小时,滤过,滤液用40%氢氧化钠溶液调节pH5~6后于水浴浓缩至干。残渣用甲醇溶解,于15000r/min离心10min,定容为50ml,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作样品溶液。

  2.3 色谱条件

  用InertsilODS-SP(5μm,250×4.6mm)色谱柱,在370nm波长、35℃柱温条件下,进样10μl,流速为1.000ml/min,以乙腈-0.3%磷酸水溶液(37:63)为流动相进行洗脱。

  2.4 系统适应性试验

  分别精密吸取2.1和2.2项下制备的对照品和供试品溶液各10μl,按2.3色谱条件项下色谱条件进行测定,记录色谱图,色谱图见图1。结果,供试品中山柰酚色谱峰的保留时间为9.09与对照品溶液一致,分离度均大于1.5,理论塔板数不低于4000,溶剂空白无干扰。色谱图见图1。

  2.5 线性关系考察

  按2.3色谱条件项下方法,精密吸取2.1项下的对照品溶液1,2,3,4,5,6,12μl,分别注入液相色谱仪,测得山柰酚面积的回归方程为y=5E+06x+18.723,r=0.9998。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标作图,在上述色谱条件下,山柰酚进样量在0.096~1.152μg范围内与峰面积的线性关系良好。山柰酚线性关系见图2。

  2.6 精密度试验

  分别吸取2.1项下的对照品溶液10μl,按2.3项下色谱条件测定6次,其峰面积RSD为1.63%,表明仪器精密度良好。

  2.7 稳定性试验

  取同一批药材(采于楚雄医专校园内的药材),按2.2项下方法制备供试品溶液,分别于配制后0,2,4,8,12,24h进样10μl,测得山柰酚的峰面积RSD为1.52%,表明供试品溶液在24h内稳定。

  2.8 重复性试验

  取同一批药材粗粉(过2号筛)6份,精密称定,按2.2项下方法制备供试品溶液,精密吸取各10μl注入高效液相色谱仪,按2.3项下色谱条件进行含量分析,山柰酚质量分数的RSD为1.42%,表明该测定方法的重复性良好。

  2.9 加样回收率试验

  取已知山柰酚含量的药材粗粉(过2号筛)6份,精密称定,每份约2g,分别加入山柰酚对照品适量,按2.2项下方法制备供试品溶液,测得山柰酚的平均回收率为98.64%(n=6),RSD=1.89,结果见表1。

  2.10 样品测定

  取药材样品粗粉(过2号筛)1g,精密称定,按2.2项下方法制备供试品溶液,精密吸取10μl,按2.3项下色谱条件进行测定,记录峰面积,计算山柰酚含量。同法测定9批样品(批号见表2),每批样品平行测定三次,其测定结果的平均值见表2。

  3 讨论

  在提取条件的选择中,为药材中的山柰酚由苷水解为游离状态,常在提取溶剂中加入一定量的酸进行水解。笔者考察了甲醇-2%盐酸、乙醇-2%盐酸、乙酸乙酯-2%盐酸等为提取溶剂进行回流和超声提取,结果显示,以乙酸乙酯-2%盐酸(4:1)为溶剂进行超声提取效果最佳。洗脱剂的选择,考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸水溶液的等度和梯度洗脱的情况,最终选择用乙腈-0.3%磷酸(37:63)洗脱进行等度洗脱分离较好。用二极管阵列检测器对山柰酚用上述条件在波长200~400nm绘出3D图谱,结果山柰酚于370nm波长处的HPLC色谱响应较大,同时各色谱峰分离度较好,故选择370nm为检测波长。

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  建立的方法稳定性、回收率、重复性和分离效果较好,能快速、准确地测定小叶女贞果实中山柰酚的含量,可用于小叶女贞果实中山柰酚的含量测定。

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