发布时间：2020-02-27所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： [摘要]目的：建立黄柏药材中总生物碱的含量测定方法。方法：采用酸性染料比色法，通过对pH值，显色剂用量，测定波长等实验条件进行筛选，寻求最佳测定条件。结果：在pH=5.2，0.03%酸性染料3mL，测定波长为415nm时，能准确测定黄柏药材中总生物碱的含量，其精
[摘要]目的：建立黄柏药材中总生物碱的含量测定方法。方法：采用酸性染料比色法，通过对pH值，显色剂用量，测定波长等实验条件进行筛选，寻求最佳测定条件。结果：在pH=5.2，0.03%酸性染料3mL，测定波长为415nm时，能准确测定黄柏药材中总生物碱的含量，其精密度、线性、重复性、回收率等均良好。结论：本含量测定方法操作方便，重现性好，准确性好，可以用于黄柏总生物碱的含量的测定。
[关键词]黄柏;生物碱;盐酸小檗碱;酸性染料比色法
1前言
黄柏为黄皮树(芸香科植物)的干燥树皮，其具有泻火除蒸，除骨蒸清虚热，解毒疗疮的药理作用[1]，黄柏药材含有多种生物碱，其中包括小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、药根碱等多种生物碱[2]，中华人民共和国药典只对小檗碱和黄柏碱进行了含量要求。本文采用酸性染料比色法对其总生物碱含量进行了测定，结果准确，重现性较好。
2仪器与试剂
2.1仪器
紫外分光光度仪(WARIANCary50)，电子分析天平(奥豪斯AX224ZH/E)，超声波清洗器(型号SK8210LHC上海科导超声仪器有限公司)，高效液相色谱仪(FL2200福立仪器)。
2.2试药
黄柏(购于湖南、四川、江西等省)，盐酸小檗碱(含量>98%，四川玉鑫药业有限公司)，溴麝香草酚蓝(天津永大化学试剂有限公司)，枸橼酸、磷酸氢二钠、甲醇、醋酸、氯仿等均为分析纯。
3方法与结果
3.1试剂的制备
3.1.1对照品的制备精密称取盐酸小檗碱6.90mg，置50mL的量瓶中，加pH=5.2枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解至刻度，摇匀，即得(138.9μg/mL)。
3.1.2供试品的制备[3]
取黄柏粗粉约5g，精密称定。加100mL醋酸-甲醇(1∶100)，50℃超声30min，滤过，滤渣同法再超声提取一次。合并滤液，至250mL量瓶中，加醋酸甲醇(1∶100)至刻度，摇匀，精密量取上述溶液4.0mL，置25mL量瓶中，加醋酸甲醇(1∶100)至刻度，摇匀，得供试品溶液。
3.1.3枸橼酸-磷酸二氢钠缓冲液的配制
pH为4.4，4.8，5.2，5.6，6.0缓冲溶液每100mL的配比如表1：
3.1.4酸性染料的配制
精密称取溴麝香草酚蓝0.05058g，溶于pH=5.2枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中并定容至100mL。
3.2酸性染料比色法条件的选择
3.2.1缓冲溶液pH的确定
精密量取3.1.1对照品溶液1mL共5份，各分别加入pH=4.4，4.8，5.2，5.6，6.0的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液8mL，再加入pH=4.4，4.8，5.2，5.6，6.0的溴麝香草酚蓝溶液3mL、氯仿4mL，振摇，静止30min后分出下层，再加入氯仿4mL同法萃取2次，合并氯仿萃取液，氯仿定容至25mL，加入0.5g无水硫酸钠脱水。在波长415nm处测定其吸光度[5]。实验表明对照品在pH=5.2时有最大吸收，结果见图1，故实验中选用pH=5.2缓冲液。
3.2.2酸性染料用量的选择
取乙醇配制的浓度为142μg/mL的盐酸小檗碱对照品1mL共6份，水浴挥干甲醇，分别加入pH=5.2缓冲液配制的溴麝香草酚蓝溶液1.5，2，2.5，3，3.5，4mL、同3.2.1中的萃取方法及测定方法进行测定。结果表明当溴麝香草酚蓝溶液加入量大于3.0mL时，吸收趋于稳定，结果见图2，所以溴麝香草酚蓝溶液的加入量为3mL。
3.2.3测定波长的选择
分别精密吸取3.1.1盐酸小檗碱对照品溶液1mL和3.1.2供试品溶液1mL，各加pH=5.2缓冲液8.0mL、溴麝香草酚蓝溶液3.0mL、氯仿4mL，振摇，静置30min后分出下层，反复萃取3次，合并氯仿萃取液，移入25mL量瓶中加氯仿至刻度，加入0.5g无水硫酸钠脱水[6]，在波长200~800nm处测定吸光度。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在波长415nm处均有稳定的最大吸收，结果如图3所示，故选择415nm为测定波长。
3.3标准曲线
分别精密量取对照品浓度55.2μg/mL、82.8μg/mL、110.4μg/mL、138.0μg/mL、165.6μg/mL的对照品1.0mL，按照3.2.3方法在波长415nm处测定其吸光度，可得回归方程y=0.0023x+0.0604，R2=0.9996，表明盐酸小檗碱浓度在40~200μg/mL之间有良好的线性关系。
3.4精密度实验
取3.1.1对照品溶液，按照3.2.3方法操作得到萃取液，摇匀，连续5次在波长415nm处测定其吸收，结果如表2。由表2可知，RSD为0.71%，n=5。仪器精密度良好。
3.5稳定性试验
精密吸取3.1.2供试品溶液1.0mL，按照3.2.3方法操作得到萃取液，摇匀，在不同时间间隔里在波长415nm处测定其吸收，结果RSD为0.99%，n=5。表明供试品溶液在5小时内基本稳定。
3.6重复性实验
分别精密量取1.0mL的3.1.2供试品溶液共5份，编号为1、2、3、4、5，分别按照3.2.3方法操作得到萃取液，分别在波长415nm处测定其吸收，结果RSD为1.09%(n=5)。表明供试品溶液重复性良好。
3.7回收率实验
精密称量药材5份粗粉约5.0g，加100mL醋酸甲醇(1∶100)，50℃超声处理30min，抽滤得滤液及残渣。用适量醋酸甲醇(1∶100)冲洗残渣和滤纸，二次超声提取残渣，加100mL醋酸甲醇(1∶100)，50℃超声处理30min，抽滤得滤液，与一次滤液合并，移入250mL容量瓶中加醋酸甲醇(1∶100)至刻度，得到黄柏提取液。精密吸取提取液2.0mL和1.72mg/mL的对照品溶液1mL混合，移入25mL容量瓶中加醋酸甲醇(1∶100)定容至刻度，得分别在波长415nm处测定其吸收，计算回收率，结果如下表2。由表2可知，样品的回收率平均达到96.9%，RSD为2.18%，n=5。
3.8样品的测定
所购样品按3.1.2供试品制备方法进行制备，按照3.2.3方法操作得到萃取液，在波长415nm处测定其吸光度，结果所购三个样品含量依次为4.83%，5.29%，5.16%。
4结论与讨论
(1)酸性染料比色法测定黄柏中总生物碱的含量的测定方法，精密度实验RSD为0.71%(n=5)，稳定性实验RSD为0.99%(n=5)。重复性实验RSD为1.09%(n=5)，回收率96.9%(n=5)。此操作方便，重现性好，准确性好，可以用于黄柏总生物碱的含量的测定。
(2)按照中国药典的方法对三批药材中盐酸小檗碱的含量进行测定，得样品中盐酸小檗碱的含量依次为3.68%，4.18%，4.02%。分别占有总生物碱的76.2%，79.0%，77.9%。由此可见，虽然黄柏中还有其他的生物碱，比如黄柏碱、药根碱、蝙蝠葛任碱、木兰花碱等，但均以盐酸小檗碱为主，并且含量占比相对稳定。
(3)采用柱色谱法对三批药材也进行了总生物碱的含量测定[7]，得到样品中总生物碱的含量依次为4.32%、4.82%、4.66%，均低于酸性染料比色法。主要可能是此法只对季铵型总生物碱进行了测定，而酸性染料比色法能对多种生物碱都能进行测定。
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