发布时间：2020-04-24所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要通过传统平板培养和16SrDNA扩增测序相结合的方法，对武汉某熟食企业鸭脖中优势腐败菌进行初步分析，为食品的保藏提供参考依据。结果表明卤鸭脖中的优势腐败菌主要为巴黎链球茵和大肠艾希氏菌。它们可能是造成鸭脖腐败的主要原因。采用选择性培养基富集培
摘要通过传统平板培养和16SrDNA扩增测序相结合的方法，对武汉某熟食企业鸭脖中优势腐败菌进行初步分析，为食品的保藏提供参考依据。结果表明卤鸭脖中的优势腐败菌主要为巴黎链球茵和大肠艾希氏菌。它们可能是造成鸭脖腐败的主要原因。采用选择性培养基富集培养后，提取DNA，进行PCR扩增，检测沙门氏菌、大肠杆菌0157、单核细胞增生李斯特氏茵、副溶血弧茵、金黄色葡萄球菌等致病菌，检出结果均为阴性。采用平板分离可检出肺炎克雷伯氏菌。
关键词鸭脖优势腐败茵致病茵16SrDNA—PCR平板分离
鸭肉以高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点而被列为首选的动物“健康食品”。鸭肉的营养价值很高，可食部分中的蛋白质含量约为16%～25%，比畜肉含量高得多J。卤鸭脖作为卤制品中的代表，营养丰富并具有独特的风味和口感，越来越受到消费者青睐。但在其制作加工的过程中易受到微生物的污染，容易引发食品安全事故，给消费者的健康造成危害_2J。我们采用16SrDNA扩增测序和传统平板分离方法，对武汉市售鸭脖的优势腐败菌进行初步分析，同时采用国标法PCR扩增检测主要致病菌，为其质量控制提供参考依据。
1材料与方法
1.1试剂与材料
DNAmarker、ExTaqDNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、GoldView核酸染料、PCA、MRS、新生霉素、CHRO等选择性培养基和添加剂。
大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌等标准菌株，均由武汉市疾病控制中心提供。金黄色葡萄球菌由本课题组保存
1.2仪器与设备
SW—CJ—IBV超净工作台;TGRADIENTPCR仪;GBOX—H12一E—M自动凝胶成像分析系统;DYY一2C电泳仪;台式高速冷冻离心机;HMB一400B拍击式均质器。
1.3方法
1.3.1增茵
在无菌操作条件下将卤鸭样品切成小块，分别称取25g切碎的样品放入无菌均质袋，在拍击式均质器下处理5—8min，将混合液分别转入PCA、MRS、EC增菌液等液体培养基，150r/min、37~(2摇床振荡12h培养。
1.3.2涂平板
取上述增菌后的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释，从1O稀释到1O～，取10一、10～、l0三个梯度，分别涂PCA和MRS琼脂平板，每个梯度涂两个平板，培养后挑取不同形态的细菌进行革兰氏染色、显微观察。
1.3.3DNA提取
SDS一酶裂解法提取DNAl3J。取1mL菌液室温下8000r/min离心5min。弃上清，将沉淀重新悬浮于lmLTE缓冲液中。加人201.~L的溶菌酶(50mg/mE)，37℃保温1.5h。再加入(5mol/L)NaC150txL，10%SDS1IOI~L，(20mg/mL)蛋白酶K3txL，55cI=保温50min后冰上放置。加入5IxLRNA酶室温放置30min，直至混合菌液变为透明粘稠液体。将菌液等量分装到2个1.5mLEP管中，每管再加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀后12000r/min、4离心10min。取上清，再用苯酚：氯仿：异戊醇抽提2次。取上清加人0.6倍体积的异戊醇(一20℃预冷)，混匀后12000r/min离心10min。用75%乙醇洗涤DNA沉淀。晾干后，将DNA溶于50txLTE缓冲液中。
1.3.416SrDNAPCR扩增
本实验采用文献报道的细菌通用引物对_4]。上游弓l物为：5一AGAGrIvITrGATCCTGGCTCAG一3。下游引物为：5一AAGGAGGTGATCCAGCC一3。预期PCR产物大小为1600bp左右。
PCR体系为：10xbuffer5.01xL，dNTP4.0，上下游引物各1.0L，模板1.0L，ExTaqDNA聚合酶0.5txL，补ddH2O至501xL。
PCR反应条件：94~C预变性5min;94cI=45s，55℃45s，72℃1.5rain，循环扩增3O次;72~C10min。取5IxLPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.3.5PCR产物纯化与测序分析
PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后，送生工生物工程(上海)有限公司武汉测序部双向测序。
1.3.6比对
用DNAstar软件将测序得到的16SrDNA基因序列进行拼接，得到16SrDNA序列，提交到NCBIGenBank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对。
1.3.7致病菌检测
将增菌后的菌液提取DNA，按国标法进行PCR扩增，检测大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌。
2结果与分析
2.1平板分离与培养
我们在2011年7月和9月间从不同门店购买同一品牌市售卤鸭脖，增菌后进行平板分离培养。其中可得到三种类型的细菌。一种在平板上的菌落为较小的圆形，边缘整齐，颜色为白色。革兰氏染色后为紫色，球形链状排列。将其分离菌株命名为菌株1。一种在平板上的菌落为较大的圆形，边缘整齐，颜色为浅黄色。革兰氏染色后为红色，杆状，呈短链状排列。将其分离菌株命名为菌株2。一种在平板上菌落为较小圆形，边缘整齐，颜色为浅黄色，革兰氏染色为红色，杆状，生理生化实验验证为大肠艾希氏菌。
2.216SrDNAPCR扩增与测序
将分离到的菌株1和菌株2的单菌落，培养后提取DNA进行16SrDNAPCR扩增(图1)。将PCR产物纯化后，送生物公司进行双向测序。将测序结果在NCBIGenBank数据库进行比对分析，菌株1与NCBI参考序列(如FJ611790)最大相似度为99%，判定为巴黎链球菌(Streptococcuslutetiensis)。菌株2与NCBI参考序列(如CP002910)最大相似度为99%，判定为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。
2.3致病菌检测
采用各种选择性培养基针对性培养富集后，将样品提取DNA，按国标法进行PCR扩增。分析方法和检测结果见表1。
3讨论
采用微生物常规培养技术分离、鉴定腐败细菌，耗时长。在卤鸭腐败菌研究中采用分子生物学检测技术，不失为一种快速准确的方法。本文通过16SrDNA~J]序和传统平板分离培养相结合的方法分析了卤鸭脖中优势腐败菌，结果表明某品牌卤鸭脖中的优势腐败菌为巴黎链球菌和大肠艾希氏菌。两种细菌均为主要腐败菌，但比例呈现一定消长变化。7月份时武汉的平均温度大概为37℃，温度较高，此时卤鸭脖中的优势腐败菌主要为大肠艾希氏菌。9月份时武汉市的平均气温为30~C，温度较7月有所下降，此时鸭脖中的优势腐败菌主要为巴黎链球菌。本文采用MRS培养基多次培养均未分离到乳酸菌，可能乳酸菌在卤鸭脖总菌相中不占主要地位。
采用选择性培养基富集培养后，提取DNA，进行PCR扩增，检测沙门氏菌、大肠杆菌0157、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌，检测结果均为阴性。但采用平板分离意外检出了肺炎克雷伯氏菌。说明生产企业和销售门店仍需加强环境消毒措施，控制致病菌的污染。
卤鸭脖经过高温卤制、杀菌工艺，能有效杀灭卤鸭脖中的绝大部分微生物，此时细菌菌群比较单一。本文初步确定了某品牌卤鸭脖中的优势腐败微生物，旨在帮助企业采取有效的加工工艺，强化食品的质量控制，为食品的保藏方法提供参考依据。
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