发布时间：2021-05-11所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要:羟基酪醇是重要精细化学品，作为天然抗氧化剂被广泛应用于食品、医药领域。通过合成生物学技术开展微生物法生产羟基酪醇具有重要的研究意义。本文首先克隆并功能鉴定了来源于大肠杆菌EscherichiacoliBL21的羟化酶编码基因HpaBC，结果表明该酶的两个亚基
摘要:羟基酪醇是重要精细化学品，作为天然抗氧化剂被广泛应用于食品、医药领域。通过合成生物学技术开展微生物法生产羟基酪醇具有重要的研究意义。本文首先克隆并功能鉴定了来源于大肠杆菌EscherichiacoliBL21的羟化酶编码基因HpaBC，结果表明该酶的两个亚基均能成功表达并能催化酪醇生成羟基酪醇。通过CRISPR-Cas9技术将由tac启动子调控的HpaBC基因表达盒整合到前期构建的酪醇高产菌株YMG5A*R基因组中，同时删除副产物乙酸的合成途径，获得大肠杆菌代谢工程菌株YMGRD1H1。摇瓶发酵实验结果表明重组菌株能够直接利用葡萄糖生产羟基酪醇，产量达到1.81g/L，同时发现几乎没有副产物积累。5L发酵罐规模的流加补料发酵实验表明羟基酪醇最高产量达到2.95g/L，是目前文献报道以葡萄糖从头合成羟基酪醇的最高水平。通过系统改造大肠杆菌，实现了羟基酪醇的大量合成，为进一步构建具有工业应用潜力的羟基酪醇细胞工厂奠定了基础，也为拓展芳香族化合物的微生物制造路线提供了有益的参考。
关键词:大肠杆菌，羟化酶，酪醇，羟基酪醇，CRISPR-Cas9
羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)也称3,4-二羟基苯乙醇(3,4-DHPEA)，分子量为154.164，是一种天然的苯乙醇类化合物，具有非常高的抗氧化活性[1-2]。长期食用橄榄油益于人体健康，其主要功能成分为羟基酪醇[3-4]。目前，羟基酪醇可应用于营养保健品、饲料、化妆品和制药等多个行业，在食品防腐剂和添加剂等领域也具有广阔的应用前景。目前，羟基酪醇主要从制备橄榄油或其废水中提取[1]，少量为化学合成，微生物生产羟基酪醇的市场占有率极低。鉴于天然提取原料的匮乏和化学合成严苛的反应条件，利用微生物的细胞工厂安全高效地生产羟基酪醇成为必然趋势。
如图1所示，在微生物细胞内以酪氨酸为底物引入不同的外源基因，可以构建多种羟基酪醇合成途径[1,5-7]。Chen等通过构建途径1和途径2两种混合途径生产羟基酪醇;针对途径3通过筛选高活性的酪氨酸羟化酶和胺氧化酶构建出了高效的生产途径，通过全细胞生物转化方法生产的羟基酪醇产量最高为4.69g/L;同时针对途径4构建了酪氨酸和葡萄糖的双途径生产羟基酪醇，但其产量依旧较低。上述代谢途径均对羟化酶等基因进行了分析及改造，或构建混合酶体系的生产方式，对后续研究具有借鉴意义[7-8]。但上述途径均主要以价格高昂的酪氨酸为底物，生产成本高;代谢途径的构建在质粒基础上进行，菌株的不稳定性易造成质粒的缺失;抗生素的使用为后期提取工艺及产品成分的限定造成阻碍，微生物发酵技术生产羟基酪醇有待进一步的研究。
本研究在前期研究[9]的基础上，将以葡萄糖为底物的酪醇高产菌株YMG5A*R作为出发菌株，进一步构建羟基酪醇高产菌株。出发菌株YMG5A*R的主要代谢途径如图2所示，该菌株是以E.coliMG1655为宿主，在敲除相关分支途径基因、调控阻遏基因等基础上，整合表达5个拷贝的酿酒酵母菌株苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10*。该重组菌能够不需要添加抗生素及诱导剂条件下利用葡萄糖生产酪醇[10]。本文在高产酪醇基础上，整合表达来源于E.coliBL21羟化酶基因HpaBC并进行乙酸副产物途径改造，实现了代谢工程菌株高效生产羟基酪醇。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株及质粒
YMG5A*R为本研究的出发菌株，研究中所用及构建的菌株和质粒如表1所示。
1.1.2引物设计
研究中所用引物如表2所示。
1.1.3试剂
研究中所用蛋白胨和酵母粉等试剂均购于赛默飞公司;无机盐等试剂均购自国药化学试剂有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海麦克林生化科技有限公司;葡萄糖、阿拉伯糖、壮观霉素、硫酸卡那霉素等购自生工生物工程(上海)股份有限公司;酪醇、羟基酪醇等标准品均购自Sigma-Aldrich(中国上海);限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ等均购自赛默飞世尔科技公司;连接酶SolutionⅠ、PrimeSTAR®DNA聚合酶、ExTaq酶、rTaq酶等均购于宝生物工程(大连)有限公司。
1.1.4培养基及缓冲
液LB培养基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl10。固体LB培养基含有2.0%(W/V)琼脂粉。灭菌条件为121℃、15min。
M9Y培养基(g/L)：Na2HPO4·12H2O17.1、KH2PO43、NaCl0.5、NH4Cl1、葡萄糖20、酵母粉0.25、5mmol/LMgSO4·7H2O。灭菌条件为115℃、15min。其中，MgSO4·7H2O母液需单独灭菌，灭菌条件为121℃、15min。
PBS缓冲液(g/L)：NaCl8、KCl0.2、Na2PO41.42、KH2PO40.27。
1.2菌株构建
1.2.1羟化酶基因HpaBC的获取及重组质粒构建
以菌株E.coliBL21基因组为模板进行PCR获得羟化酶基因HpaBC(GenBank登录号：CP053601.1)，通过引物将两个限制性酶切酶位点EcoRⅠ、HindⅢ分别引入基因两端。
将pEtac质粒和HpaBC基因用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切后，用SolutionⅠ连接酶进行连接，转入E.coliJM109感受态细胞中，筛选获得JM109/pEtac-HpaBC菌株。
1.2.2重组菌株构建
采用化学转化法将构建的重组质粒pEtacHpaBC转入酪醇高产菌株YMG5A*R中，获得游离表达羟化酶的重组菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC。
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采用CRISPR-Cas9技术[11]对出发菌株YMG5A*R基因组中产乙酸的关键基因poxB和ackA、pta[12]分别进行敲除。采用融合PCR的方法将poxB上下游同源臂进行连接，获得poxB敲除盒，将其与质粒pTargetF和pCas共同转入菌株YMG5A*R中筛选获得阳性克隆，消除质粒后获得poxB基因敲除的菌株YMGRD1。采用相同的方法构建ackA-pta基因敲除的菌株YMGRD2。采用上述方法获得tac-HpaBC基因整合表达盒，将其与质粒pCas和pTargetF共同转入菌株YMG5A*R中，筛选获得阳性克隆YMGRD1H1。
1.3摇瓶发酵条件
将保藏的菌种在LB固体培养基上划线培养，挑取单菌落接种于装有20mLLB液体培养基的100mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养过夜。按1%接种量，转接含有50mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养10h后收集菌体。将其用无菌水洗一次，转接至装有50mLM9Y液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、200r/min培养48h。每隔12h取样检测OD600和产物含量。其中，游离表达羟化酶时，菌体浓度OD600达到0.5时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导。培养基中所需抗生素主要包括：卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(100mg/L)。
1.4SDS-PAGE电泳条件
将YMG5A*R/pEtac-HpaBC菌株在LB培养基中诱导培养24h后，6000r/min离心10min，收集菌体。将菌体水洗一次后，用25mLPBS缓冲液重悬，破壁后离心取上清及沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳验证。
1.5发酵罐发酵条件
将菌株活化培养，以1%接种量接种到装有50mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养至OD600为1.5–2.0时，按照10%的接种量接种于装有2LM9Y培养基的5L发酵罐中。
发酵过程通气比恒定为1.5vvm，逐渐增加搅拌转速维持发酵液DO值30%–40%至最高转速600r/min;流加200g/L酵母粉母液(8mL/次)补充菌株生长所需养分促进菌株生长，继续维持溶氧浓度。采用两阶段控温发酵，0–14h为37℃，14–48h为30℃。发酵过程中，通过流加氨水自动控制发酵液pH=7.0。每间隔4h取样检测OD600、葡萄糖、酪醇和羟基酪醇产量。根据检测结果，控制流加葡萄糖至终浓度维持在5g/L。
1.6检测方法
1.6.1酪醇、羟基酪醇检测方法
将发酵液沸水浴15min，离心收集上清，并采用微孔滤膜过滤。高效液相色谱(HPLC)分析条件如下：流速1mL/min;流动相为80%(V/V)的甲酸(0.1%，W/V)和20%(V/V)的纯甲醇;博纳艾杰尔C18柱(4.6mm×250mm，5μm);柱温28℃;波长为280nm;紫外检测器;进样量为10μL。
1.6.2有机酸检测方法样品处理同1.6.1方法。HPLC分析条件如下：流速0.5mL/min;流动相为5mmol/L稀硫酸;博纳艾杰尔有机酸分析柱(7.8mm×300mm，9μm);柱温55℃;RID示差法检测器;进样量为10μL。
1.6.3葡萄糖检测方法葡萄糖采用生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行检测。
2结果与分析
2.1羟化酶HpaBC的表达
采用质粒pEtac表达羟化酶HpaBC，将构建的重组菌YMG5A*R/pEtac-HpaBC进行诱导培养并SDS-PAGE电泳分析。如图3所示，重组菌的全细胞电泳(泳道3)和细胞沉淀部分(泳道5)均有两条显著的蛋白电泳条带，其大小分别在58kDa和19kDa左右，与4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaB)和黄素还原酶(HpaC)的理论分子量一致，表明HpaBC成功表达。由泳道4可以看出，在细胞破碎液的上清部分中，仅有明显的HpaB蛋白条带，表明HpaC基因表达产物多为包涵体。
2.2羟化酶HpaBC活性验证
研究中进一步验证了HpaBC基因表达产物是否具有催化生产羟化酪醇的活性。如图4所示，重组菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC发酵48h，羟基酪醇产量达0.15g/L。但对照菌株YMG5A*R发酵液中未检测到羟基酪醇积累，证明表达的HpaBC酶具有催化活性。但游离表达HpaBC酶时，重组菌的羟基酪醇产量较低，需要进一步改造提升羟基酪醇产量。
2.3乙酸合成途径敲除
在羟基酪醇发酵生产过程中，重组菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC存在乙酸积累和pH降低等现象。大肠杆菌中的乙酸途径主要包括两个：①丙酮酸经poxB基因表达的丙酮酸氧化酶转化为乙酸;②乙酰辅酶A经ackA、pta基因表达的乙酸激酶和磷酸转乙酰酶转化为乙酸。分别敲除菌株YMG5A*R中基因poxB、ackA-pta，构建了重组菌株YMGRD1和YMGRD2并考察乙酸合成水平。——论文作者：刘春筱1,2，夏媛媛1,2，齐丽娜1,2，杨海泉1,2，陈磊1,2，沈微1,2，陈献忠1,2
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