发布时间：2021-10-15所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要在自然界，角是野生动物抵御天敌、争夺配偶的工具，但在规模化养殖中，天生无角是有利性状，可减少管理成本和保护动物福利。牛(Bostaurus)无角性状呈常染色体显性遗传，具有多等位基因特点，目前已知有3类不同来源的无角等位基因(奶牛:Friesian;肉牛、乳
摘要在自然界，角是野生动物抵御天敌、争夺配偶的工具，但在规模化养殖中，天生无角是有利性状，可减少管理成本和保护动物福利。牛(Bostaurus)无角性状呈常染色体显性遗传，具有多等位基因特点，目前已知有3类不同来源的无角等位基因(奶牛:Friesian;肉牛、乳肉兼用牛:Celtic;蒙古牛:Mongolian)。为了开发准确高效的牛无角基因分子检测方法，研究基于整合竞争性等位基因特异性PCR(kompetitiveallele-specificPCR,KASP)和微流控芯片技术的检测平台，根据3种不同类型的结构变异设计特异性引物，建立了针对3种牛无角基因的快速诊断方法。通过对采自国内外不同牛品种的样本检测，并与PCR扩增测序和凝胶电泳等传统检测方法的结果相对比，证明新方法可以对3种无角基因准确分型，适于规模化检测应用。此外，本研究首次在我国三河牛品种中鉴定出Mongolian无角等位基因，同时在Friesian无角等位基因序列中新发现一个2bp缺失，可作为无角基因特异标记。研究结果为开展无角牛的分子选育提供了技术手段。
关键词竞争性等位基因特异性PCR(KASP);无角基因;三河牛;分子检测;微流控芯片
在自然界中，牛角是抵御天敌、争夺配偶的工具(Robinsonetal.,2006;Johnstonetal.,2013);而在集约规模化养殖条件下，角的存在不仅给动物间带来互相伤害，也给饲养管理人员带来安全威胁，故天生无角是牛人工养殖生产中的有利性状。牛的无角性状遗传方式为常染色体显性遗传，具有多等位基因的特点，目前已知在普通牛(Bostaurus)中有3类不同来源的无角基因：Celtic等位基因(Medu‐goracetal.,2012)，存在于以安格斯牛、西门塔尔牛等肉牛或乳肉兼用牛品种中，遗传机制是1号染色体内的一段212bp序列的重复，代替了长度为10bp的序列;Mongolian等位基因(Medugoracetal.,2017)，发现于蒙古牛中，遗传机制是1号染色体一个219bp的插入;Friesian等位基因(Medugoracetal.,2012)，存在于以荷斯坦牛、娟姗牛为代表的奶牛品种中，遗传机制是1号染色体上一个80kb片段的重复。
开发灵敏、准确的牛无角基因的检测方法，鉴定不同无角基因的基因型，对于培育无角牛具有重要应用价值。目前国外研究者已报道了几种传统的分子检测技术，例如PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(Celtic,Mongolian,Friesian)(Medugoracetal.,2012;Medugoracetal.,2017;Wiedemaretal.,2014)、PCR扩增产物毛细管电泳(Celtic,Friesian)(Wiedemaretal.,2014;Medugoracetal.,2012)、Sanger测序(Frie‐sian)(Wiedemaretal.,2014)。但这些检测方法存在明显缺陷：1)没有统一的检测技术能够同时对3种无角等位基因进行分型;2)琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序等传统检测方法，操作步骤多、耗时长，无法实现快速检测;3)针对Friesian无角基因，已报道的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，只能判断是否携带无角基因，无法区分无角等位基因的杂合子和纯合子，未达到精确分型的效果。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitiveallele-specificPCR,KASP)是近年来新出现的一种DNA变异分型技术，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，具有准确、灵活、成本低的特点(Heetal.,2014)，对SNP、Indel及大片段缺失插入等不同变异类型均可检测(Zhangetal.,2020)。本研究基于KASP和微流控芯片技术的检测平台，开发针对3种牛无角基因的快速诊断方法，以适于规模化检测应用。
1材料与方法
1.1样本及基因组DNA提取
样本采自不同品种普通牛(Bostaurus)共39头，其中奶牛9头，品种为荷斯坦牛和娟姗牛;肉牛和兼用牛17头，品种包括安格斯牛、西门塔尔牛(样本来源于德国和美国)、夏洛莱牛和利木赞牛;我国地方品种(三河牛、秦川牛和蒙古牛)牛12头。这些样本都具有表型信息，除秦川牛、蒙古牛样本为血液，其余样本均为冷冻精液。
利用试剂盒(基因组DNA提取试剂盒DP304，北京天根生化科技有限公司)提取血液样本DNA。利用高盐法提取牛冻精基因组DNA，具体步骤如下：1)将冻精置于2mL离心管中，加入500μL生理盐水，涡旋混匀，12000r/min离心1min，倒去上清液保留沉淀。该步骤重复1次。2)向沉淀中加入400μL二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)裂解液、100μL20%的十二烷基硫酸钠溶液(sodiumdodecylsulfate,SDS)，放置一段时间后涡旋，使之完全溶解，再加入10μL蛋白酶K，颠倒混匀。随后将样品置于56℃水浴锅中消化20~22h。3)取消化好的样品，加入300μL饱和食盐水，颠倒2~3min，放入4℃冰箱静置一会，随后在4℃下12000r/min离心10min，将上清液转移至新离心管中。4)离心管中加入1000μL无水乙醇，颠倒1~2min，12000r/min离心2min，倒去上清液保留DNA沉淀。5)装有DNA沉淀的离心管中加入500μL75%的乙醇，颠倒混匀，12000r/min离心2min，倒去上清液保留DNA沉淀。该步骤重复1次后，开盖放置使乙醇完全挥发。6)离心管中加入100μL56℃的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，4℃过夜，沉淀溶解。
最后利用ThermoScientificNanoDrop2000对基因组DNA质量、浓度进行检测。
1.2基于整合KASP和微流控芯片技术的无角基因检测
SNP分型采用基于微流控芯片的SNP检测系统(iMAP,北京博奥晶典生物技术有限公司)，其原理是在微流控芯片上完成基于等位基因特异扩增原理的KASP分型。所用微流控芯片大小为75mm×25mm×2mm，具有112个反应孔，分布于4排，每排28个孔，每个反应孔体积1μL。除去预留作为对照的16个空白孔位(4个/排×4排)，该系统可以在2.5h内实现对96个样本(24个/排×4排)的分型检测(Luetal.,2019)。
1.2.1特异性引物设计
根据3种无角等位基因的序列特征设计KASP特异性引物(表1)。
Celtic等位基因是牛1号染色体上1705834~1706045bp(牛UMD3.1版本参考基因组，下同)之间一段212bp序列发生重复，该重复代替了一段位于1706051~1706060bp长度为10bp的序列，该位点表示为P202ID(Medugoracetal.,2012)。本研究根据P202ID重复序列末端的碱基差异性设计引物(图1B)。
Mongolian等位基因有两个特异性突变位点，一是在1975461~1975487bp处存在1bp的缺失(CTGAATC被替换为TCTGAA)，表示为P1ID;二是在1976128bp处存在一个219bp的插入，表示为P219ID(Medugoracetal.,2017)。本研究针对P1ID设计引物(图1C)。
Friesian等位基因存在5个紧密连锁的候选突变位点，其中3个是单核苷酸多态(SNP)，分别为：1654405bp处G→A(PG1654405A);1655463bp处C→T(PC1655463T);1768587bp处C→A(PC1768587A)。另外2个为插入缺失(InDel)，即在1649163~1649169bp处有一段5bp的InDel(P5ID)、在1909352~1989480bp后存在一段长度为80128bp的串联重复(P80kbID)，该串联重复内部还存在一个SNP(1909354:T→A)和一个2bp的缺失(1909396D2:TG)(Medugoracetal.,2012)。本研究针对此2bp缺失和PC1768587A分别设计了1组特异性引物(图1A)。
每个引物组合含3条引物，包括上游引物2条和下游引物1条，其中2条上游引物是根据位点等位基因序列差异而设计的，在KASP扩增过程中分别加上不同的荧光基团，即羧基荧光素(FAM,car‐boxyfluorescein)和六氯荧光素(HEX,hexachlorofluorescein)，最后根据PCR产物荧光信号进行基因型分型。引物由北京博奥晶典生物技术有限公司合成。
1.2.2竞争性等位基因PCR(KASP)
表1中的4组引物，每组引物与模板DNA、PCR预混液以及双蒸水组成一个PCR反应体系，共组成4个PCR反应体系，每个PCR反应体系的体积为1μL。每个PCR反应体系中包括引物混合液0.14μL，PCR预混液(2×universalKASPMasterMix,LGC)0.50μL，DNA模板5~10ng，双蒸水补齐到总体积1μL。其中引物混合液中2条等位基因特异性引物浓度均为12µmol/L，下游通用引物浓度30µmol/L。上述4个PCR反应体系可同时在微流控芯片(北京博奥晶典生物技术有限公司,产品编号G020010)上进行扩增反应，扩增程序均为：95℃变性15min，之后为降落PCR(touchdownPCR)扩增10个循环，变性温度95℃，退火温度在10个循环中从61℃降落到55℃，每个循环变性20s、延伸60s;然后为常规PCR扩增26个循环，变性温度95℃，退火温度55℃，每个循环变性20s、延伸60s;最后37℃延伸60s。
PCR反应完成之后，利用荧光信号扫描仪(北京博奥晶典生物技术有限公司，产品型号LuxScan10K/D)进行扫描，生成图像文件，通过软件转换成数据信号值，根据荧光信号的散点图判定基因型。
1.3KASP分型结果验证实验
1.3.1引物合成
利用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在线设计软件，根据牛参考基因组(Bostauru⁃sUMD3.1;GenBank登录号GCA_000003055.5)核苷酸序列，对P80kbID位点分别设计出一条正向和反向引物。其他位点P202ID(Medugoracetal.,2012)，PC1768587A(Wiedemaretal.,2014)，P219ID(Medugoracetal.,2017)引物序列来自文献报道(表2)。引物由擎科新业生物技术有限公司合成。
1.3.2目标序列的扩增与凝胶电泳测序
以样本基因组DNA为模板进行目标序列的扩增。PCR反应体系总体积25µL，其中10×Buffer2.5µL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)2µL，Taq酶(5U/µL)0.5µL，上下游引物(20µmol/L)各0.5µL，基因组DNA模板1µL(约50ng)。PCR反应条件：94℃预变性5min;然后35个循环，94℃变性30s，在引物对应的退火温度下复性30s，72℃延伸30s;最后72℃延伸7min。整个扩增反应在AppliedBiosystems9700型PCR仪内完成。
P219ID、P80kbID和P202ID位点的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测分型。制作浓度为2%的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物4µL点样，在TAE缓冲液中110V电压下电泳20min，在凝胶成像系统中观察电泳结果。PC1768587A位点采用PCR产物直接Sanger测序分型。
2结果与分析
2.1KASP检测结果
利用KASP方法对所有39个样本将3种不同类型无角基因同时进行检测，Celtic无角基因P202ID位点分型散点图如图2A所示，检测到8个无角纯合子，6个无角杂合子;Mongolian无角基因P1ID位点分型散点图如图2B所示，检测到1个无角杂合子;Friesian无角基因P80kbID、PC1768587A位点分型散点图分别如图2C、图2D所示，联合检测到9个无角突变个体，其中包括1个纯合子和8个杂合子。
2.2Friesian无角基因序列分析
针对Friesian无角基因，本研究起初设计基于P80kbID位点的分型方法，但检测结果显示，该位点虽然能检测出有无Friesian无角基因，但无法确定是纯合子和还是杂合子。经Sanger测序发现，野生型序列(图3A)与突变型(图3B)的第一个80kb拷贝序列在P80kbID位点的基因型完全一致，因此即使是突变型纯合子，也会产生与野生型等位基因的检测信号。为解决此难题，我们引入另外一个与Friesian无角基因关联的突变位点(PC1768587A)，用于辅助判定无角基因的纯合子或杂合子，检测结果”CA”为无角杂合子，”AA”为无角纯合子。与此同时，在对Friesian无角基因进行Sanger测序时发现，在第2个80kb的串联重复的起始处有一个长度为2bp的缺失(AG)(图3C;3D)。
2.3验证实验结果
利用PCR扩增和凝胶电泳实验以及Sanger测序对KASP检测结果进行验证。Celtic无角基因P202ID位点检测结果如图4A所示，其中长度为345bp的条带对应野生型，长度为547bp的条带对应无角纯合子，双条带对应无角杂合子。在17个肉牛或乳肉兼用牛样品中，共有8个Celtic无角基因纯合子、6个杂合子和3个野生型。对Mongolian无角基因P219ID位点检测结果如图4B所示，其中长度为895bp的条带对应野生型，双条带对应无角杂合子。在包括蒙古牛、秦川牛和三河牛在内的13个样品中，仅有1个三河牛样本基因型为无角杂合，其余全为野生型。Friesian无角基因P80kbID位点检测结果如图4C所示，其中长度为300bp的条带对应突变型，无条带泳道对应野生型。在包括荷斯坦牛和娟姗牛在内的9个奶牛样本中，有6个突变型，3个野生型。利用PC1768587A位点对Friesian无角基因进行基因分型，在6个突变型中，有5个无角杂合子(图4D,左)，1个无角纯合子(图4D,右)。
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将两种检测结果汇总后进行对比(表3)，对KASP检测结果进行评估。结果表明，KASP的检出率为100%，并且分型结果与分子实验结果完全一致。
3讨论
KASP是一种新型的SNP分型方法，具有快速、准确、灵活性高等优势(Heetal.,2014;Zhangetal.,2020)，在不同领域得到广泛应用。有报道利用KASP技术对儿童遗传性耳聋进行检测(Luetal.,2019)，Rasheed等(2016)对影响小麦重要经济性状的功能基因进行检测，对小麦适应性、产量和品质等进行筛选，以实现遗传改良(Semagnetal.,2014)。Zhang等(2020)设计荷斯坦奶牛常见的8种遗传缺陷的检测方法。KASP分型技术的关键在于引物设计，本研究选取无角基因的特异性位点，包括Celtic无角基因位点P202ID，Mongolian无角基因位点P1ID成功设计了分型引物。但针对Friesian无角基因，本研究起初设计基于P80kbID位点的分型方法，但初步检测显示，P80kbID能检测出有无Friesian无角基因，但无法确定是纯合子和还是杂合子，原因是经Sanger测序发现，野生型序列与突变型的第一个拷贝序列在P80kbID位点的基因型完全一致。故我们引入另外一个与Friesian无角基因密切关联的突变位点(PC1768587A)，用于辅助判定无角基因的纯合子或杂合子，实现Frie‐sian无角基因准确分型。为了提高检测效率，本研究使用了整合KASP与微流控芯片的检测技术(Luetal.,2019)，使点样、反应、分型等基本操作单元集成到一块75mm×25mm×2mm的芯片上，自动完成分析过程，该技术适用于无角基因大规模检测。
本研究对蒙古牛、秦川牛和三河牛等中国黄牛品种的无角基因进行鉴定，首次在三河牛中检测到Mongolian基因P1ID位点的存在。Mongolian基因最早由Medugorac等(2017)利用76头牛基因组测序数据，从蒙古国的蒙古牛(MongolianTuranocattle)上发现的，该无角基因在我国地方牛品种的分布还没有报道。三河牛主要分布在我国内蒙古额尔古纳右旗三河地区，是我国培育的第一个乳肉兼用品种。该品种为西门塔尔牛、西伯利亚牛和俄国改良牛(如后贝加尔土种牛、塔吉尔牛等)与当地蒙古牛经过长期杂交后选育而成(吴宏军等,2012)，故我们推测三河牛中无角基因很可能来自于蒙古牛。
Friesian基因共有5个候选突变，本研究中选择P80kbID和PC1768587A两个位点设计特异性引物利用KASP进行检测。此前有报道表明P80kbID为Friesian基因最可能的致因突变，而PC1768587A和P80kbID高度连锁，从表3检测结果可知检出率和准确率均为100%，证明了突变位点的检测准确性。值得注意的是，本研究所检测的2个德国西门塔尔牛样本(编号6、8)内，既检测到P202ID位点，也检测到PC1768587A和P80kbID这两个位点。进一步对这两个样本进行PCR扩增和Sanger测序后，结果与KASP一致。说明这2个样本同时携带Celtic、Friesian两种不同无角等位基因。有研究表明(Schafberg等,2015)，人类对无角牛特殊的培育历史使得Friesian和Celtic无角基因逐渐开始渗透。Wiedemar等(2014)也发现Friesian基因也存在于少数西门塔尔牛中，而Celtic基因也存在于少数荷斯坦奶牛。Allais等(2013)和Rothammer等(2014)的研究结果也验证了这一观点。本研究所开发的KASP检测方法的优势在于对多个无角基因位点可同时进行检测，达到准确分型的效果。
此外，本研究在对Friesian基因P80kbID位点内两个串联重复进行Sanger测序时发现，在第2个80kb的串联重复开始有一个长度为2bp的缺失(AG),此前研究未报道该缺失的存在，属首次发现。该分子标记可以用于设计新的特异引物，进一步优化Friesian基因的检测方法。
4结论
本研究利用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术开发了3种类型无角基因的联合分子检测方法。与常规分子实验技术相比，该方法能够实现无角基因的高效、快速、准确检测;在中国本地牛品种中首次鉴定发现Mongolian无角基因，为无角黄牛的选育奠定了分子遗传基础;在Friesian无角基因内发现一个此前未报道的2bp缺失位点，为今后优化检测方法提供了可能。——论文作者：颜泽1肖炜2张胜利1王雅春1张毅1*
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