流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法

发布时间：2022-03-03所属分类：农业论文浏览：1789次

摘 要： 摘 要: 相对于动物和微生物而言，流式细胞术在植物科学上的应用会因植物组织与细胞( 如细胞壁、中央液泡、特殊细胞器等) 的特殊结构以及次生代谢产物等特殊成分，造成样品在前期处理、染色及测试等方面的困难，甚至导致检测失败或结果不准确。笔者在长期运用流式细胞仪

　　摘 要: 相对于动物和微生物而言，流式细胞术在植物科学上的应用会因植物组织与细胞( 如细胞壁、中央液泡、特殊细胞器等) 的特殊结构以及次生代谢产物等特殊成分，造成样品在前期处理、染色及测试等方面的困难，甚至导致检测失败或结果不准确。笔者在长期运用流式细胞仪测试工作中，积累了大量的植物样本检测经验，并参考国内外相关文献，总结出从植物取材、样品制备到植物细胞核 DNA 流式检测的方法和技巧，可为植物科学研究者及从事流式细胞检测的技术人员提供实验参考。

　　关键词: 流式细胞术; 高等植物; 细胞核 DNA 含量; DNA 解离液

　　流式细胞仪( flow cytometer) 的诞生标志着在单细胞水平上定性、定量分析及分选检测技能的快速发展，并在血液学、免疫学、肿瘤学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床检验中得到了广泛应用。但在植物学研究领域中，由于植物组织与细胞结构复杂，使流式细胞仪在植物科学中的应用滞后于其它学科。近 30 年来，随着流式细胞仪多功能开发、多参数流式分析与分选技术建立、流式样品制备技术的不断更新，流式细胞术在植物科学领域如植物遗传育种、植物染色体分析与文库构建、逆境植物学、植物分类学、植物病理学等各个学科中显示出广阔的应用前景[1]。

　　大多数生物体遗传信息编码的 DNA 定位于细胞核，DNA 含量的检测技术是开发最早、应用最广泛、最基本的流式细胞术之一[2，3]。Galbraith 等[2]和 Hare 等[4]研究开发了流式细胞仪检测植物细胞核 DNA 含量的方法，从而促进了植物学前所未有的发展。流式细胞仪检测 DNA 含量的原理是利用特殊的荧光染料( PI、DAPI、AO 等) 与细胞内 DNA 碱基结合，在一定的压力下染色细胞进入流式细胞仪的流动室，经激光照射后发射出荧光，通过滤片可收集到每个细胞相应的荧光强度，再根据染色细胞的荧光强度即可推算出细胞的 DNA 含量。流式细胞术不仅能对植物细胞计数、检测基因组大小、DNA 含量及其倍性水平、物种入侵能力，还能分选出不同周期不同时期的细胞、染色体及构建文库等，这为植物细胞生物学研究提供了有力的工具及检测手段。

　　利用流式细胞术检测植物细胞核 DNA 含量和倍性，对描述物种特征、分类及遗传学研究都十分重要。我们在检测植物样品时经常会遇到大量 DNA 碎片的干扰，主要原因是植物细胞结构( 如细胞壁、中央液泡) 及成分( 次生代谢产物等) 的特殊性和复杂性。笔者在长期运用流式细胞仪进行测试的工作中，积累了丰富的植物样本检测经验，同时参考大量的国内外文献，对植物样品检测中的关键环节，如植物样品制备、提取 DNA 的缓冲液选择、标准品选择和流式细胞检测方法等方面进行归纳，总结出了植物细胞核 DNA 流式检测的方法和技巧，可为植物科学研究者和从事流式细胞仪操作的技术人员提供参考。

　　1 植物细胞核 DNA 制备

　　1. 1 植物材料选择

　　测试前对植物材料进行选择和样本制备是关系到流式细胞仪检测细胞核 DNA 成功与否的关键，若检测中样本出现大量细胞碎片则会遮掩细胞核 DNA 信息，影响流式细胞仪检测样本细胞核的成峰效果和检测结果的准确性。一般植物取材需要考虑样品易获性、细胞核型的稳定性和保存性等一系列问题。植物样品最好选取新鲜的叶片或者幼嫩叶片，因其较易获得合适的单细胞悬液，但也有研究者选取植物的根、茎等其它部位。例如，Dolezel 等[3]利用植物根尖分生组织制备染色体细胞悬液，对植物组织和细胞进行了 DNA 含量、倍性研究; Saito 等[5]利用流式细胞仪对萱草属植物物种和栽培品种的叶、根、根状茎、花梗进行了倍性分析，发现叶基部组织是最合适的材料。在野外采集中由于受条件限制，研究者经常采用湿滤纸包裹植物样本并装入密封塑料袋中置于冰盒保存，带回实验室后再置于-70℃冰箱中保鲜; 还有使用自然风干和快速干燥等方法保存样品的。Suda 等[6]对新鲜、冻存、干燥的维管束植物样本进行了流式细胞核 DNA 含量测定可行性的比较研究，发现利用维管束植物快速脱水干燥方法保存的样品进行流式细胞核 DNA 测定是可行的，这使那些难以得到新鲜材料的稀有物种或不便及时处理的样品也能够利用流式细胞仪进行检测成为了现实，促进了植物系统学、生态学和种群生物学的研究和发展。

　　1. 2 DNA 核解离液的选择

　　流式细胞仪要求被检测的植物样本必须是完整的单细胞或细胞核悬液。在制备植物单细胞悬液时会产生大量的碎片，干扰细胞核 DNA 含量的检测。目前还未发现能适合于所有物种的通用解离液。Loureiro 等[7]以芦苇作为材料比较了 4 种解离液( Galbraith's /LB01 /OTTO/Tris·MgCl2 ) 的测 试效果，发现 LB01 和 OTTO 解离液的效果最好，且 OTTO 对一些 DNA 含量较低的物种也能得到较好结果。根据不同植物的组成特性，选择合适的植物细胞核解离液将有助于细胞核的完全游离。如一些植物( 臭椿、拟南芥、猕猴桃等) 体内含有较高浓度的淀粉、多糖、磷酸钙等新陈代谢类的黏性物质，为了消除酚类黏性物质的影响，在提取细胞核悬液时需加入体积浓度为 1%的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP) 。Li 等[8]采用 Hepes 缓冲液分析发现了迄今为止最高倍性( 10 倍体) 的猕猴桃。Chen 等[9]采用 WPB 缓冲液分析得到枸杞物种基因组的大小，枸杞果实含有许多胞浆化合物( 如酚酸类化合物和黄酮类化合物) ，会干扰细胞核 DNA 荧光染色，加入偏亚硫酸氢钠和黏合剂 PVP-10 可以防止酚和次级代谢产物等的干扰。笔者参考国外文献[10，11]并结合对来自深圳市仙湖植物园 120 份蕨类和苔藓植物样本的实验发现，LB01 解离液比其它种类解离液更适合该类植物的细胞核裂解。表 1 中列出了实验中常用的 8 种植物细胞核解离液及其配方，以供大家参考。

　　1. 3 参照样本的选择原则

　　流式细胞仪可以通过内标和外标法进行细胞核 DNA 含量测定。常规的倍性分析多采用外标法，而更精确的倍性分析建议采用内标法，如检测异倍体。内标法可参照样本已知的染色体倍性，推算测试样品细胞核 DNA 的绝对含量，以避免因待测样品的变异和机器工作状态不稳定带来的误差。内标法的参照样本应满足以下条件: 参照样本细胞核 DNA 含量已知且稳定，同目标样本细胞核 DNA 含量相近; 参照样本与目标样本的基因组大小范围相近; 标准样本峰不能同目标样本峰重叠，最好与目标样本的 G2 或 M 期峰值不重叠。

　　目前在植物细胞核 DNA 含量的研究中仍采用鸡血红细胞用作植物材料的内参标准，鸡血红细胞来源多，测定结果稳定。如 Roux 等[12]以鸡血红细胞作为内参对照，用流式细胞仪检测了香蕉细胞核 DNA 含量和染色体数目; Phivnil 等[13]用已知的大麦品种细胞核 DNA 含量作为对照鉴定了多个猕猴桃品种的倍性。常用参照样本的倍性和细胞核 DNA 含量可见参考文献[14，15]。

　　1. 4 荧光核酸染料的选择

　　不同荧光探针的选择对检测植物细胞核 DNA 含量至关重要，细胞核染料主要分 2 种，特异标记和非特异标记染料。特异标记 DNA 荧光染料是非嵌入染色，主要与 DNA 的 A-T 碱基结合，忽略了 DNA 还有很多 G-C 碱基，会造成检测基因组值偏小。因此最常用是非特异染料( 如 PI) ，但此方法操作时会使 DNA 和 RNA 也同时被染上色，需要降解 RNA 的干扰。现将流式细胞仪常用荧光核酸染料及其检测波长和特性列于表 2。

　　1. 5 植物样本优化

　　制备好的植物样品最好采用过滤方法和离心方法进一步去除细胞碎片和黏连细胞，这非常有利于流 式细胞仪上机检测和成峰效果。Lee等[16]通过比较 PVP 设计的棉花滤管过滤法与尼龙网过滤法对提取液的过滤效果，结果显示用棉花滤管过滤的提取液能够去除多醣体，效果优于尼龙网; 于红梅等[17]利用流式细胞仪检测草莓染色体倍性时，以匍匐茎尖或根尖的细胞为材料，在常规提取液中添加巯基乙醇，采用细胞核 DNA 悬浮液离心漂洗 3 次后再经 300 目尼龙网过滤的方法，得到了理想的结果。裸子植物有较厚的角质层，细胞内次生代谢物质多，需要较长时间解离细胞核 DNA，比被子植物更难制备出完整的细胞核悬浮液。因此，制备的新鲜样品如果当天检测细胞核 DNA 的信号不佳，可将样品放置冰箱避光 1～ 2 d 后再上机检测，效果也许会更好。

　　2 流式细胞仪检测植物样本

　　2. 1 建立流式检测的方案

　　植物种类繁多，染色体倍性复杂、多样。植物细胞普遍存在内复制现象，往往以多倍体的形式存在，造成细胞核 DNA 含量的变化范围较大，从 2C 到 16C，甚至到 128C，因此对这类植物多倍体宜采用动态范围宽的对数形式。有些情况下植物细胞核 DNA 倍性变化范围很窄，可以参照动物和人细胞动态范围小的线性关系，则能更清楚地显示不同物种间的变化。

　　本文来源于：《植物科学学报》Plant Science Journal(双月刊)本刊主要刊载植物学及各分支学科的原始研究论文，植物学研究的新技术、新方法，综合评述(应结合作者本人的研究工作、反映本学科在国内外的最新研究进展)、研究简报、学术讨论、重要书刊评介和学术动态等。

　　植物物种众多，细胞大小差异较大，有些植物细胞较小，容易与碎片混淆。实际操作中，如果流式细胞仪的 FSC 阈值调得太高，细胞与碎片会被一起去掉，反之细胞与碎片则无法分开。我们的经验是，首先根据植物细胞大小，确定植物细胞群位置，排除其它杂质、背景噪音的干扰，即确定合适前向散射光( FSC) 阈值; 其次是去除黏连细胞，其目的是避免假阳性结果，保证多倍体细胞与黏连细胞不被混淆。流式细胞仪去除黏连细胞的方案有许多，常规方法是根据细胞面积和宽度来设计去除黏连细胞。然而，在实际应用中也发现一些样品的检测效果不好，可换成采用侧向散射光( SSC) 和 PI 荧光染料的通道去除黏连细胞以获得较理想的结果，这主要是 SSC 参数能够更好地反映细胞核聚集。因此，建立最佳流式细胞仪检测方案、调节合适电压也是流式细胞仪检测植物细胞核 DNA 含量的关键步骤。

　　2. 2 应用实例

　　流式细胞术是一种简单、快速、高通量检测植物倍性水平、种内杂交、单性生殖，以及基因组的大小、多倍体和性染色体的方法。Cousin 等[18]在 6 h 内对 192 例芸苔属植 物 采 用 96 孔 板 BeadBeating 制备方法，通过流式细胞仪进行了细胞核 DNA 含量测定，摸索出大规模高通量检测的方法，且保证了数据和样品的可重复性，是非常值得借鉴的一种制备植物样品的方法。Dolezel 等[19]通过比较 4 个实验室不同的操作人员、不同方法、不同仪器估计细胞核 DNA 基因组的大小，结果显示各实验室间差异较小; 使用 Galbraith buffer 和 PI 能够测定大多数植物种类的绝对基因组大小，PI 比 DAPI 更可靠、更适合用于评估植物基因组的大小; 当基因组差异较小时，应该在同一实验室使用相同的仪器来消除系统性误差。在长期实验过程中我们发现制备植物细胞核 DNA 样本最关键的是选择合适的细胞核解离液。采用烟草和油菜为材料对 8 种 DNA 缓冲液进行比较，我们发现 Hepes 缓冲液适合于大多数植物，变异系数最小; 其次是 Tris· MgCl2和 LB01( 图 1) 。对于倍性相对复杂的植物，因倍性越高，变异系数也越大，应选择与之相近的物种标准品作内参，以避免或减小误差。笔者在此将本实验室近期使用流式细胞仪( BD 公司，AriaⅢ 型) 检测植物细胞核 DNA 含量样本的使用方法归纳列于表 3，供大家参考。

　　总之，针对不同植物种类需要根据物种特性采用不同的制备细胞核 DNA 方法。我们也将在今后的实验中不断地探索，以期总结出更好的方法。——论文作者：汪 艳* ，肖 媛，刘 伟，李婷婷，胡 锐，乔志仙

　　参考文献:

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　　[2] Galbraith DW，Lambert GM，Macas J，Dolezel J. Analysis of nuclear DNA content and ploidy in higher plants[J]. Curr Protoc Cytom，2001，7 ( 6) : 1-22.

　　[3] Dolezel J，Bartos J. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size[J]. Ann Bot， 2005，95( 1) : 99-110.

　　[4] Hare EE，Johnston JS. Genome size determination using flow cytometry of propidium iodide-stained nuclei[J]. Methods Mol Biol，2011，772: 3-12.

　　[5] Satio H，Mizunashi K，Tanaka S，Adachi Y，Nakano M. Ploidy estimation in Hemerocallis species and cultivars by flow cytometry[J]. Scientia Horticulturae，2003，97: 185-192.

　　[6] Suda J，Trávnicek P. Reliable DNA Ploidy determination in dehydrated tissues of vascular plants by DAPI flow cytometry———new prospectsfor plant research[J]. Cytometry A，2006，69( 4) : 273-280.

　　[7] Loureiro J，Rodriguez E，Dolezel J，Santos C. Comparison of four nuclear isolation buffers for plant DNA flow cytometry[J]. Ann Bot，2006，98 ( 3) : 679-689.

　　[8] Li ZZ，Man YP，Lan XY，Wang YC. Ploidy and phenotype variation of a natural Actnidia arguta population in the east of Daba Mountain located in a region of Shaanxi[J]. Scientia Horticulturae， 2013，161: 259-265.

　　[9] Chen JJ，Liu XL，Zhu LY，Wang Y. Nuclear genome size estimation and karyotype analysis of Lycium species[J]. Scientia Horticulturae，2013， 151: 46-50.

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