发布时间：2022-05-09所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘 要 褪黑素具有调节昼夜节律、抗氧化等生物活性，因此测定不同类型马齿苋的褪黑素含量，可为后续开发马齿苋相关功能性产品提供理论依据。采用高效液相色谱法测定马齿苋褪黑素，色谱柱为 Angilent 5 TC-C18 (250 mm4.6 mm, 5 m);流动相为 50 mmol/L 磷酸氢二钠(pH=4.5
摘 要 褪黑素具有调节昼夜节律、抗氧化等生物活性，因此测定不同类型马齿苋的褪黑素含量，可为后续开发马齿苋相关功能性产品提供理论依据。采用高效液相色谱法测定马齿苋褪黑素，色谱柱为 Angilent 5 TC-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为 50 mmol/L 磷酸氢二钠(pH=4.5)-乙腈(77:23);柱温为 28 ℃;流速为 1 mL/min;进样量为 10 μL;检测波长为 223 nm。结果表明褪黑素在 100~4 000 ng/mL 浓度范围内与峰面积的线性关系良好(R=0.9999)，平均加样回收率为 99.58%，RSD 值为 1.83%，六个马齿苋干燥饮片的褪黑素含量在 0~35.917 ng/g，其中河北产地的褪黑素含量最高，而在山东、四川和江苏等产地中未检测到褪黑素成分;六个马齿苋新鲜叶片中褪黑素含量在 0.493~139.911 ng/g，其中荷兰类型的褪黑素含量最高，而在茎中未检测到褪黑素成分。因此，马齿苋褪黑素的含量差异性不仅体现在不同类型之中，同时在同一样品的不同部位之间也存在较大差异，其中以荷兰类型的马齿苋鲜品为佳。
关键词 马齿苋; 褪黑素; HPLC
褪黑素，一种具有调节昼夜节律、抗氧化、神经保护等功能的吲哚胺类物质(Marino and Hernndez-Ruiz, 2018)，作为膳食补充剂的使用占全球褪黑素需求的 52.5% (Pérez-Llamas et al., 2020)。目前市场上的褪黑素膳食补充剂基本上是由合成褪黑素制成的，然而褪黑素在合成过程中会伴随着大量副产品的出现，比如1,1'- 乙叉二膦-色氨酸(Peak E)，5-羟色胺衍生物，5-甲氧基色胺衍生物等(Williamson et al., 1997; Naylor et al., 1999)。这些副产品通常是与色氨酸相关的化合物，如 Peak E，与嗜酸性粒细胞肌痛综合征(EMS)有关，一种无法治愈和致命的疾病(Williamson et al., 1998; Cerezo et al., 2016)。此外，还有一些非常快速、简单和廉价的方法如由邻苯二酰亚胺合成褪黑素的途径，该方法不仅可产生多种污染物，且需要有毒的底物或催化剂(Prabhakar et al., 1999; He et al., 2003; Thomson and Aurélien, 2003)。虽然现代一些化学合成色氨酸衍生物的方法可以减少副产品的出现(Bartolucci et al., 2015; 2016)，但是市场上对于褪黑素的合成污染物也无法得到完全的排除。因此，寻找替代人工合成的褪黑素具有重大意义。
在很长一段时间里，褪黑素被认为是动物里特有的一类神经激素，直到 1995 年，Dubbels 等(1995)发现在高等植物中也存在褪黑素。有研究表明，芳香植物与药用植物具有较高的褪黑素，同时植物褪黑素还 “伴随”其他抗氧化活性物质如酚类、黄酮类、类胡萝卜素等(Pérez-Llamas et al., 2020)，这些物质可能与褪黑素产生协同作用进而增强褪黑素的生物活性，可作为提取植物褪黑素的重要植物来源。马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科(Portulacaceae)马齿苋属(Portulaca)一年生草本，具有清热解毒，凉血止血等功效，可用于热毒血痢、湿疹、丹毒，在中国南北各地均产，资源丰富，属于药食同源的一种植物(Zhou et al., 2015)。有研究者发现在新鲜马齿苋中存在褪黑素(Simopoulos et al., 2005)，同时课题组前期也在江苏马齿苋干燥饮片中测得褪黑素含量为 686.17 ng/g (瞿星洪和可燕, 2020, 中国食物与营养, 26(11): 77-81.)，在植物中处于较高水平。然而植物中褪黑素含量的累积易受到环境条件影响，由于马齿苋分布的广泛性，其褪黑素含量可能存在地域差异性。因此，本研究对不同类型马齿苋的褪黑素含量进行测定，为后续开发马齿苋相关功能性产品提供理论依据。
1 结果与分析
1.1 样品中褪黑素的分离效果
在“3.5”项条件下，马齿苋样品中的褪黑素分离良好，无杂质峰干扰(图 1)。
1.2 线性关系考察
按“3.5”项下色谱条件进样三次，以对照品褪黑素浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，计算得线性回归方程为 A=0.0694C-4.4938 (R=0.9999)，结果表明，褪黑素在 100~4 000 ng/mL 浓度范围内线性关系良好。
1.3 精密度、重复性和稳定性试验
分别取标准品褪黑素溶液和马齿苋样品溶液，按“3.5”项下色谱条件测定六次，计算得到标品和样品的褪黑素峰面积 RSD 值分别为 0.78%和 1.60%，表明该方法精密度和重复性良好。取马齿苋样品溶液，分别于 0、2、4、8、12 和 24 h 按“3.5”项下色谱条件测定，计算得到样品褪黑素峰面积的 RSD 值为 1.71%，表明褪黑素样品在 24 h 内稳定性良好。
1.4 加样回收率试验
取加标后制备的样品溶液适量，按“3.5”项下色谱条件进行液相测定，计算得到马齿苋褪黑素的平均加样回收率为 99.58%，RSD 值为 1.83% (表 1)。
1.5 样品含量测定
取马齿苋各个样品制备的供试品溶液适量，按“3.5”项下色谱条件进样三次，计算样品中褪黑素的含量 (表 2; 表 3)。根据马齿苋干燥饮片的褪黑素含量测定结果可知，六个马齿苋干燥饮片的褪黑素含量在 0~35.917 ng/g，河北产地的马齿苋褪黑素含量最高，其次是浙江、广东，但在山东、四川和江苏产地的马齿苋饮片里未检测到褪黑素成分，而课题组前期在江苏马齿苋中测得较高褪黑素含量 686.17 ng/g，这表明马齿苋褪黑素含量不仅存在显著的地域差异性，不同批次之间也存在较大差异。有研究发现植物褪黑素的含量可随着植物的生长发育变化而变化(Korkmaz et al., 2014)，不同的加工处理方式对于褪黑素含量也具有不同程度的影响(Pothinuch et al., 2011)。由于国内马齿苋资源的分散性与野生型等特征，该药材来源于各个地区药农的采集，在采收地点、采收时间以及药材处理方面均缺乏统一标准，所以以上因素均很有可能导致不同产地以及不同批次药材的差异性。本实验还对不同马齿苋新鲜样品中褪黑素进行叶和茎的分开测定，六个新鲜马齿苋中叶片褪黑素的含量在 0.493~139.911 ng/g，其中荷兰类型叶片中的褪黑素含量最高，且远远高于其他五个马齿苋样品，同时也远远高于 Simopoulos 等(2005)在新鲜马齿苋叶片中测得的褪黑素含量 19 ng/g，但是在茎中未检测到该成分。因此，马齿苋褪黑素含量不仅在不同类型中存在显著差异，在同一样品的不同部位中也存在较大差异。
2 讨论
本研究分别考察了乙腈-水、0.1%甲酸-乙腈和 50 mmol/L 磷酸氢二钠(pH=4.5)-乙腈等流动相体系。结果表明 50 mmol/L 磷酸氢二钠(pH=4.5)-乙腈作为流动相时，马齿苋褪黑素能得到很好的分离，且无杂峰干扰，同时该方法灵敏度高，重复性好，可用于不同类型马齿苋褪黑素的含量测定。
植物中褪黑素的含量水平一般在 pg/g~ng/g 之间，虽然含量较低，但研究表明植物褪黑素可被胃肠道吸收，血液褪黑素水平得到显著的提升，同时有研究表明给予大鼠相同剂量的豆芽褪黑素提取物与人工合成褪黑素，前者的血浆褪黑素水平是后者 1.2 倍(Rebollo-Hernanz et al., 2020)。此外，年轻人、中年人和老年人摄入含褪黑素的甜樱桃、李子或葡萄汁不仅可以提高机体的抗氧化能力(Garrido et al., 2010; Gonzalez-Flores et al., 2011; 2012)，其睡眠质量参数如睡眠潜伏期和睡眠时长都得到积极的改善(Howatson et al., 2012; Garrido et al., 2013)。这说明通过摄入植物褪黑素提高体内的褪黑素水平以改善身体机能是一个很好的选择。就植物褪黑素而言，它是一种天然的物质来源，排除任何由于化学合成而污染的可能性，相比合成褪黑素更容易被大众所接受。因此，可选择富含褪黑素的植物进行提取与富集。
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马齿苋，一种药食两用的植物，资源丰富，价廉易得。本实验基于褪黑素调节昼夜节律、改善睡眠质量、抗氧化等生物活性以及课题组前期在江苏马齿苋干燥饮片中检测到较高含量的褪黑素，对不同类型马齿苋褪黑素的含量进行测定，结果表明不同类型马齿苋之间其褪黑素含量存在差异性，不同批次也存在较大差异，同时在一些马齿苋样品中未检测到褪黑素成分，一方面可能本身就不存在褪黑素，另一方面可能与该批马齿苋的采摘期有关，Afreen 等(2006)对于常用的药用植物甘草研究发现，褪黑素在 3~6 个月植株的根中可以检测到，但在 1 个月植株的根组织中却检测不到褪黑素的存在，而马齿苋在不同时期褪黑素的含量是否也存在类似现象还有待进一步考察。本次实验测得马齿苋干燥饮片的褪黑素含量都较低，结合褪黑素不稳定、易氧化降解性质，在加工、储存过程中都会对褪黑素成分造成不同程度的损失，所以为了能够最大化的获取植物中的褪黑素，更宜选择马齿苋鲜品。此外，本实验所研究的马齿苋鲜品均是在同一环境条件下由种子繁殖而来的，但从样品测定结果来看，不同马齿苋样品之间褪黑素含量存在显著差异，所以褪黑素含量的差异性不仅是受环境因素影响，植物本身的遗传特性也发挥着一定的作用。从马齿苋鲜品中叶与茎的褪黑素测定结果可得，就植物褪黑素而言，食用新鲜马齿苋叶片的营养价值远高于茎的，作为中国主要栽培品种荷兰马齿苋相比其他类型的马齿苋不仅在褪黑素含量上占显著优势，同时该类型可周年供应，有机规模种植，避免了农药污染、更安全、卫生，具有更好的应用前景，可作为提取植物褪黑素的备选马齿苋类型。
3 材料与方法
3.1 实验材料
褪黑素(批号:KJ1807CA14, HPLC≥98%, 上海源叶生物技术有限公司)。
马齿苋样品，S1~S6 为马齿苋干燥饮片，S7~S12 为马齿苋新鲜药材，经上海中医药大学可燕教授鉴定为马齿苋科植物马齿苋 Portulaca oleracea (表 4)。
3.2 仪器与试剂
Angilent 1260 型高效液相色谱仪(美国 Angilent 公司);旋转蒸发器 RE-52AA (上海亚荣生化仪器厂); Eppendorf 离心机(Gene Company Limited);固相萃取小柱 Bond Elut C18，500 mg 6 mL (美国 Angilent 公司);洁盟牌超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司)。
乙腈、甲醇、磷酸以及磷酸氢二钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)均为色谱纯。
3.3 标准品溶液制备
精密称取褪黑素标准品适量，甲醇溶解，配制成 0.1mg/mL 的标准品母液。
3.4 供试品溶液制备
对 Chen 等(2003)提取褪黑素方法进行改进提取马齿苋褪黑素。新鲜马齿苋的叶与茎液氮研磨成粉末，干燥马齿苋打粉过筛。称取马齿苋粉末 20.0 g，置于 200 mL 棕色广口瓶中，加入 120 mL 甲醇冰水浴超声提取 30 min，4 000 r/min 离心 15 min，取上清液于圆底烧瓶中，通过旋转蒸发器将其旋干，残渣取 50%甲醇 6 mL 溶解，所得溶液过 0.22 μm 滤膜后转入分别经 5 mL 甲醇和 5 mL 超纯水活化后的固相萃取小柱，先取 10%甲醇 5 mL 冲洗除去部分杂质，最后取 80%甲醇 1 mL 洗脱，收集的洗脱液过 0.22 μm 滤膜后置于棕色 EP 管备用。提取过程应全程避光。
3.5 色谱条件
色谱柱为 Angilent 5 TC-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相：50 mmol/L 磷酸氢二钠(pH=4.5)-乙腈 (77:23);柱温：28 ℃;流速：1 mL/min;进样量：10 μL;检测波长：223 nm。
3.6 线性关系考察
取褪黑素标准品母液分别配制成浓度为 100、200、500、1000、2000、4000 ng/mL 溶液。按“3.5”项下色谱条件进行液相测定，平行进样三次，以标准品褪黑素浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，进行线性回归。
3.7 精密度、重复性和稳定性试验
取标准品褪黑素溶液按“3.5”项下色谱条件测定六次，计算褪黑素峰面积的相对标准偏差(RSD)。称取 S1 马齿苋粉末 20.0 g，平行 6 份，按“3.4”项下方法制备马齿苋样品溶液，按“3.5”项下色谱条件测定并计算褪黑素峰面积的 RSD。称取 S1 马齿苋粉末 20.0 g，平行 6 份，按“3.4”项下方法制备马齿苋样品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h，按“3.5”项下色谱条件测定并计算褪黑素峰面积的 RSD。
3.8 加样回收率试验
取已知成分含量的 S1 马齿苋粉末 20.0 g，平行 6 份，精密加入标准品褪黑素 400 ng，按“3.4”项下方法制备马齿苋样品溶液，按“3.5”项下色谱条件测定并计算褪黑素的平均加样回收率及 RSD。
3.9 样品含量测定
取马齿苋各个样品，按“3.4”项下方法制备马齿苋样品溶液，按“3.5”项下色谱条件进样三次，计算马齿苋褪黑素的含量。
作者贡献赵琦是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作;蒋嘉烨，赵可，邓剑宇参与实验设计和试验结果分析;可燕是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。——论文作者：赵琦 可燕* 蒋嘉烨 赵可 邓剑宇
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