发布时间：2022-05-10所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘 要：【目的】 探究马齿苋重要次生代谢产物成分及其在不同部位相对含量及联系。【方法】 以马齿苋根茎叶为研究对象，利用高效液相色谱串联质谱进行代谢组学分析。【结果】 马齿苋中生物碱、类黄酮、香豆素与木脂素以及萜类所含的种类及化合物分别有 3 类 43 种、7 类
摘 要：【目的】 探究马齿苋重要次生代谢产物成分及其在不同部位相对含量及联系。【方法】 以马齿苋根茎叶为研究对象，利用高效液相色谱串联质谱进行代谢组学分析。【结果】 马齿苋中生物碱、类黄酮、香豆素与木脂素以及萜类所含的种类及化合物分别有 3 类 43 种、7 类 34 种、2 类 16 种和 3 类 5 种，热图分析表明，这 4 类次生代谢产物在马齿苋茎和叶中的相对含量较根部更为接近;生物碱在根部和叶部总体含量较高;类黄酮在茎部总体含量较高;萜类以及香豆素与木脂素在根茎叶部含量依次递增。【结论】 马齿苋不同部位所含生物碱、类黄酮、香豆素与木脂素以及萜类种类相同，但相同成分在不同部位含量差异较大。
关键词：马齿苋;代谢组学;代谢产物;化合物;成分分析
0 引言
【研究意义】植物次生代谢产物包括生物碱、萜类及类黄酮等，这些次生代谢产物不仅有益植物自身对逆境的忍耐力，同时，也是人类生活必不可少的重要物质，涉及营养保健、天然色素、天然药物或者药物前体等应用[1]。马齿苋科马齿苋属马齿苋(Portulaca oleracea L.)被列为首批 78 种药食同源植物之一[2]，广泛分布于我国大江南北以及东南亚、南亚、中东、中欧等世界各地[3−5]。马齿苋富含生物碱、萜类、黄酮类以及香豆素与木脂素等重要次生代谢产物，但不同地区马齿苋品种不同，相关次生代谢产物含量也略有差异[6]。【前人研究进展】传统上，人们习惯将马齿苋作为野菜或中草药来使用[7,8]，现代研究证实其含有生物碱、黄酮类、萜类及香豆素类等重要次生代谢产物活性成分[9−12]，具有降血糖血脂、预防心血管疾病、增强人体免疫力、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤及抗动脉粥样硬化等多种功效[13−15]。马齿苋的化学成分复杂，种类较多，目前有大量关于马齿苋化学成分测定及提取等研究报道[16,17]，但由于提取技术原因，导致所测马齿苋成分不全[18,19]。同时，不同地区的马齿苋野生种群间存在成分差异，同一种群马齿苋受土壤及气候条件等影响，具体成分或含量也有差异[20]。【本研究切入点】代谢组学是对生物体在某一生理时期，相对分子量在 1000 以内的小分子代谢物系统进行分析的一门新型学科[21,22]。因此采用该技术可准确分析马齿苋根茎叶在某一生理时期重要次生代谢产物的具体成分和相对含量。【拟解决的关键问题】本研究以福建闽南及广东潮汕等地区常见马齿苋野生种为研究对象，利用高效液相色谱串联质谱(UPLC- MS/ MS)进行叶、茎和根代谢组学分析，以期系统获取马齿苋中生物碱、类黄酮、香豆素与木脂素以及萜类等重要次生代谢产物的具体成分和相对含量，为进一步进行马齿苋相关功效成分提取利用等研究工作打下良好基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料在夏季 7 月中旬，从福建省农业科学院亚热带农业研究所种质资源圃采取长势茂盛的绿叶、红茎和白根的马齿苋野生种，取根、茎和叶各 3 个生物样重复，每份约 60 g，用 75% 酒精洗净甩干后装入自封袋标号，快速保存于−80 ℃ 超低温冰箱备用。
1.2 试验方法
1.2.1 样品提取 从−80 ℃ 超低温冰箱取出待测样品于冻干机中真空冷冻干燥后，利用研磨仪在 30 Hz 频率下研磨干燥样品 1.5 min 至粉末状;每个样品粉末各称取 100 mg 溶解于 0.6 mL 70% 的甲醇提取液;为提高提取率，样品提取液需放置于 4 ℃ 冰箱过夜且期间涡旋 6 次;进一步在转速 10 000 g 离心 10 min 后取上清液，用 0.22 μm pore size 微孔滤膜过滤样品后保存于进样瓶中，用于 UPLC-MS/MS 测试分析。
1.2.2 色谱分析 利用超高效液相色谱(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A， https://www.shimadzu. com.cn/)分析马齿苋样品所需条件为：色谱柱(1.8 μm，2.1×100 mm)流动相 A 相和 B 相皆为加入 0.04% 乙酸的超纯水和乙腈。洗脱梯度中 5%～95% B 相， 0～10 min;95% B 相维持 10～11 min;95%～5% B 相，11～11.1 min;5% B 相维持至 14 min。液相色谱流速为 0.35 ml·min−1;柱温维持在 40 ℃ 条件;进样量为 4 μl。
1.2.3 串联质谱分 串联质谱(Applied Biosystems 4500 QTRAP，http://www.appliedbiosystems. com.cn/)条件中电喷雾离子源(ESI)温度为 550 ℃，质谱电压在 5500 V 下，帘气(CUR)压力为 30 psi，碰撞诱导电离(CAD)时所设置的参数为高。三重串联四级杆质谱(QQQ)原理中，通过优化的去簇电压(DP)及碰撞能(CE)进行每个离子对扫描检测[23]。
1.2.4 代谢物的定性与定量 根据百迈客科技有限公司所建的采用化学标品或同公共库的二级谱图进行比对建立的数据 库 MWDB(metware database)，通过二级谱信息进行代谢物的定性，分析时去除了 K +、Na+、NH4 +及大分子量物质的碎片离子等同位素重复信号。利用软件 Analyst 1.6.3 处理质谱数据。同时，利用 QQQ 质谱的多反应监测模式(MRM)进行代谢物定量。在 MRM 模式中，通过四级杆筛选代谢物母离子时，需排除其他分子量物质对应的离子。母离子经电离后断裂形成的碎片离子，再通过 QQQ 过滤选择，获得所需要的一个特征碎片离子。以上定性定量后获得马齿苋根、茎和叶各 3 个样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分和积分校正，具体步骤详见参考文献[24]。
1.2.5 数据统计分析 利用 WIN7 DPS 7.05 版软件对数据进行统计学分析，采用 LSD 法进行多重比较，字母表示结果取 5% 显著水平。
2 结果与分析
2.1 马齿苋 4 种次生代谢产物分析
在马齿苋根茎叶各 3 个生物学重复共 9 个样品中，检测到化合物有生物碱类 43 种、黄酮类 34 种、香豆素与木脂素 16 种、萜类化合物 5 种。在马齿苋根茎叶中进行相关代谢产物相对含量热图分析，结果表明(图 1)：以上 4 类次生代谢产物在茎和叶中的相对含量较根部更为接近;生物碱在根部和叶部含量高于茎部;类黄酮在茎部含量高于根部和叶部;香豆素与木脂素以及萜类在根茎叶部含量依次递增。
2.2 43 种生物碱分析
通过化学标准品验证或通过公共库的二级谱图进行比对，共获取 43 种生物碱，分为酚胺、生物碱及吲哚类生物碱等 3 类(表 1)，其化合物分别有 12、25 和 6 种。这些化合物中，N-反/顺式阿魏酰酪胺在根部含量较高;马齿苋酰胺 B 和胆碱在叶部含量较高;而 N'-阿魏酰腐胺、马齿苋酰胺 C 和 2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3-酮在根部含量极低， 5-羟基吲哚-3-乙酸在叶部含量极低。 2.3 34 种黄酮类分析相关研究方法所获取的 34 种黄酮类化合物中，分为 6 类(表 2)，具体包括：黄烷醇、异黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮醇、黄酮、二氢黄酮醇和花青素，其化合物分别为 4、2、6、9、10、1和 2 种。这些化合物中，山柰酚 3-O-β-(2″-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸) 和橙皮素 O-丙二酰基己糖苷在茎和叶部含量均较高;而含量较低的化合物较多，其中叶部 3 种、茎部 2 种、根部 10 种。
2.4 16 种香豆素与木脂素分析
16 种香豆素与木脂素中，木脂素所含化合物为 10 种，香豆素所含化合物为 6 种(表 3)。这些化合物中，秦皮甲素和七叶苷在茎和叶中含量均较高;松脂醇二葡萄糖苷在茎和根部含量显著低于叶部;丁香树脂酚-乙酰葡萄糖在茎部含量极低，丁香树脂酚-己糖在根部含量极低。
2.5 5 种萜类化合物分析
5 种萜类化合物包括 3 种倍半萜以及三萜和三萜皂苷各 1 种(表 4)。这些化合物中，獐牙菜苷在叶部含量较高，獐牙菜苦苷在茎叶部含量均较高;3'- O-D-葡萄糖酰龙胆苦苷在根部含量极低，铁冬青酸在茎和叶部含量均极低。
3 讨论与结论
马齿苋作为传统的药食同源植物，一直以来不断有类黄酮、生物碱及萜类等相关成分的研究报道 [25−27]，但受限于技术手段和研究方法，相关成果不够系统，所测成分也不够全面[28]，因此，相关文献报道所获具体成分数量偏少或相关成分具体含量存在较大误差。高效液相色谱串联质谱可对植物的具体成分进行系统性的定性定量分析，本研究通过高效液相色谱串联质谱进行马齿苋代谢组学分析，首次系统获取其生物碱类、黄酮类、萜类化合物、香豆素与木脂素等 4 类重要次生代谢产物，发现其化合物分别有 43、34、16 和 5 种。对以上代谢产物在马齿苋根茎叶中的相对含量进行热图分析，发现该 4 类次生代谢产物在茎和叶中的相对含量较根部更为接近;通过比较 4 类重要次生代谢产物在马齿苋根茎叶中的含量可知，生物碱在茎部总体含量偏低，类黄酮在茎部总体含量偏高，香豆素与木脂素以及萜类在根茎叶部含量依次递增。由于生物碱类、黄酮类、萜类化合物、香豆素与木脂素等 4 类重要次生代谢产物共 98 种化合物在马齿苋根茎叶部的具体含量差异明显，因此，本研究对该 98 种化合物进行归类，同时详细列举了各化合物在根、茎和叶部的相对含量，为进一步从事马齿苋上述功效成分提取利用及功效评价等工作提供理论依据。
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虽然不同地区马齿苋野生种群不同，且受土壤及气候条件等影响，即使同一种群马齿苋的具体成分或含量也存在差异[29,30]，但同科属的马齿苋绝大多数相关成分及其含量差异不明显。本文以福建闽南及广东潮汕等地区常见马齿苋野生种群为研究对象，对其根、茎和叶的相关重要次生代谢产物进行定性定量分析，从而系统阐述了该地区马齿苋根、茎和叶片中所含生物碱类、黄酮类、萜类化合物、香豆素与木脂素等重要次生代谢产物及其相对含量，为其他地区马齿苋种群相关成分及含量等研究提供参考意义。——论文作者：张少平，李 洲，练冬梅，姚运法，赖正锋，吴松海，鞠玉栋*，洪建基*
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