发布时间：2020-02-13所属分类：工程师职称论文浏览：1次
摘 要： 摘要：基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(UHPLC-QTOF-MS/MS)联用技术，对栽培两面针不同部位(根、茎、枝)的生物碱进行比较分析，并对其中的氯化两面针碱，白屈菜红碱进行定量，为栽培两面针的质量控制提供依据。色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1100
摘要：基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(UHPLC-QTOF-MS/MS)联用技术，对栽培两面针不同部位(根、茎、枝)的生物碱进行比较分析，并对其中的氯化两面针碱，白屈菜红碱进行定量，为栽培两面针的质量控制提供依据。色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1×100mm，1.7μm)，流速0.5mL/min，柱温35℃，检测波长为272nm，流动相：A(0.1%甲酸-水)，B(乙腈)，梯度洗脱，PDA检测器，ESI正离子模式采集。根据获得的母离子和二级碎片离子精确质量数信息，结合对照品及文献，从两面针根、茎、枝中鉴定了37个成分，其中，30个成分为共有成分。4年生栽培两面针根部、茎、枝氯化两面针碱的含量范围为0.12%~0.23%，白屈菜红碱的含量范围为0.06%~0.15%：该方法分辨率好、灵敏度高，可用于两面针药材的定性定量分析，有助于对该药材的品质进行深入研究。
关键词：栽培两面针;生物碱;液质联用
两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC，又名入地金牛、蔓椒、双面针、双背针等，为芸香科花椒属藤本植物，主要分布于广西、浙江、福建、湖南、广东等地，以广西资源最为丰富[1]，具有活血化瘀，行气止痛，祛风通络，解毒消肿等功效，用于跌打损伤，胃痛，牙痛，风湿痹痛，毒蛇咬伤;外治烧烫伤等[2]，已广泛应用于日化和中医药产业。据报道，市场中以两面针为原料的中成药品种达60余种，每年市场需求量高达2400t以上。由于市场需求量大，两面针药材野生资源由于过度采伐而日益匮乏，近年来，人们已开展了两面针的栽培、良种选育及规范化种植技术等方面研究，并取得了成功[3,4]，然而，栽培两面针的化学成分及其质量控制还鲜有报道。为了保证临床用药的安全、稳定和有效，亟需对栽培两面针的化学成分及质量控制方法进行深入研究。近年来，液质联用技术已广泛应用于生物、环境、医药等领域的定性定量分析[5]，特别是超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(UHPLC-QTOF-MS/MS)，可以进行非目标物定性筛选分析[6,7]，根据采集获得的母离子和二级碎片离子精确质量数信息，结合对照品及文献可以对中药材中的化学成分进行快速鉴定。根据已有报道，两面针的主要活性成分为生物碱类成分，2015版《中国药典》规定两面针的药用部位仅为根部[2]，容易对两面针资源造成浪费。为了资源的可持续开发利用，本文采用UHPLC-QTOF-MS/MS技术，对4年生栽培两面针不同部位(根、茎、枝)的生物碱进行鉴定及含量比较研究，旨在探明栽培两面针不同部位的化学成分差异，为栽培两面针药材的质量控制，临床用药安全，更好地合理利用栽培两面针不同部位药用资源提供科学依据。
1实验部分
1.1材料
栽培两面针采自南宁，广西柳州两面针集团邕宁那马镇锦亮村两面针GAP种植基地，随机采挖3个不同的4年生两面针植株，并分为根、茎、枝不同部位。所有采集到的两面针样品都经过广西药用植物园胡东南高级工程师严格鉴定，均为芸香科植物两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.
1.2仪器与试剂
WatersAcquityI-CLASSUHPLC超高效液相色谱系统(WatersCorporation,Milford,MA,USA);XEVOG2-S高分辨率四极杆飞行时间串联质谱仪(WatersCorporation,Manchester,UK);乙腈、甲醇(色谱纯,MerckKGaA,Darmstadt,Germany);甲酸(98%-100%,Merk,EMDMilliporeCorporation，BillericaMA,USA);水为Milli-Q系统超纯水(Millipore,Bedford,MA,U.S.A.)，其余试剂均为分析纯。氯化两面针碱购自中国药品生物制品检定研究院(批号110848-200507)，白屈菜红碱由课题组分离得到，经核磁、质谱确定结构，纯度经HPLC检验>98%。
2实验方法
2.1色谱条件
液相条件：色谱柱WatersUPLCAcquityBEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm);流动相0.1%甲酸(v/v，A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~0.8min，10%~13%B;0.8~5.0min;13%~25%B;5.0~6.5min;25%~28%B;6.5~9.0min;28%~35%B;9.0~11.0min;35%~75%B;11.0~12.0min;75%~90%B;12.0~13.0min;90%~10%B;13~15min，10%)。流速0.5mL/min;检测波长：272;柱温：40℃。进样量0.5μL。
质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI),由于生物碱类成分在正离子模式下响应更强，碎片信息更丰富，因此离子扫描模式选择正离子模式。质谱参数设置为：雾化气(N2)流速为800L/h,脱溶剂气温度为350,℃离子源温度为100,℃毛细管电压为3.0kV。锥孔电压40V,补偿电压为80V。数据采集方式为MSE，在该模式下，低能量扫描碰撞能量为6eV,高能量扫描碰撞能量为35～50eV，反吹气流速为40L/h，质量扫描范围为m/z100～1200。采用亮氨酸-脑啡肽(精确质量数：m/z556.2771)作为内标(LockSprayTM)对仪器的质量轴进行实时校正,流速为5μL/min。所有数据采用MassLynx4.1(WatersCorporation,Milford,MA,USA)软件进行分析处理。
2.2对照品溶液的制备
精密称取氯化两面针碱、白屈菜红碱2mg，分别用甲醇稀释,配成0.1mg/mL的标准溶液储备液，4℃保存。进样前根据需要稀释，并用0.22μm滤膜过滤。
2.3供试品溶液的制备
称取2.0g两面针药材置50mL锥形瓶中，加入30mL70%甲醇，涡旋混匀，室温浸泡30min后超声提取30min。冷却，过滤，滤液转移至50mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。
3实验结果与讨论
3.1质谱分析结果
采用UHPLC-QTOF-MS/MS方法在正负离子模式下对4年生栽培两面针根、茎、枝不同部位进行分析，结果表明，正离子扫描模式下信号响应较强。两面针不同部位(+)ESI-MS质谱基峰离子流图(BPI)见图1。共检测了37个化合物，其中30个化合物为根、茎、枝共有的成分。根据Q-TOF-MS得到的母离子及碎片离子的精确质量信息，结合文献，对两面针中的生物碱成分进行鉴定。例如峰26，27在ESI+模式下得到m/z348[M]+(C21H18NO4)，其二级质谱均得到m/z332[M-CH4]+，318[M-C2H6]+，304[M-CH4-CO]+，290[M-C2H6-CO]+的碎片峰。参考文献[8]，并结合对照品，峰26，27分别鉴定为两面针碱，白屈菜红碱，该类生物碱属于苯并菲啶类生物碱，是两面针药材中生物碱的主要结构。采用类似的方法，通过比较给出的母离子和二级质谱信息，结合文献和对照品，对两面针药材中20种化合物进行了鉴定，结果见表1。
3.2含量测定结果
采用UHPLC方法，对4年生栽培两面针的根、茎、枝不同部位中的氯化两面针碱和白屈菜红碱进行了含量测定，每份样品平行操作3份，结果见图2和表2。
结果表明，4年生栽培两面针根部和茎部中，氯化两面针碱和白屈菜红碱的含量差异不大，枝条部位含量较少。
4结论
两面针为多年生植物，生长较为缓慢。前期的研究表明，栽培两面针至少需要3年以上，根部氯化两面针碱才能达到药典的标准[9]。
生物碱类成分是两面针的主要化学成分，根据UHPLC-QTOF-MS/MS图谱，栽培两面针根、茎、枝不同部位生物碱类成分十分相似，其中木兰花碱、延胡索生物碱、α-花椒碱、两面针碱、白屈菜红碱、茵芋碱、花椒碱是其中含量最高的生物碱成分，且在根部和茎部的生物碱含量差别不大，枝条中含量较少。2015版《中国药典》规定，两面针以根部入药，其中氯化两面针碱含量不低于0.13%。检测结果表明，4年生栽培两面针根部和茎部中氯化两面针碱的含量已超过药典标准(均大于0.2%)，枝条中的含量亦已达到0.13%，说明除了根部，茎和枝条同样具有药用价值，特别是茎部，其化学成分类型及含量与根部极其相似。由于药典规定仅以根部入药，造成两面针资源的严重浪费，建议可与根部一起作为药用部位，以缓解两面针资源的紧缺。
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