发布时间：2020-01-04所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 【摘要】目的建立HPLC方法同时测定小儿退热口服液中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚含量。方法采用WelchUltimateXB-C18(250mm4.6mm，5m)色谱柱;以甲醇-0.2%磷酸为流动相，梯度洗脱;流速：1.0ml/min;检测波长：绿原酸为330nm，栀子苷为240nm，黄芩苷、丹皮酚
【摘要】目的建立HPLC方法同时测定小儿退热口服液中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚含量。方法采用WelchUltimateXB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱;以甲醇-0.2%磷酸为流动相，梯度洗脱;流速：1.0ml/min;检测波长：绿原酸为330nm，栀子苷为240nm，黄芩苷、丹皮酚为278nm。结果绿原酸在0.35～17.29μg/ml范围内线性关系良好(r=1)，平均加样回收率为100.57%，RSD为1.41%(n=6);栀子苷在2.43～121.56μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9999)，平均加样回收率为99.95%，RSD为0.15%(n=6);黄芩苷在3.36～169.84μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9999)，平均加样回收率为100.29%，RSD为1.17%(n=6);丹皮酚在0.51～25.18μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9998)，平均加样回收率为101.06%，RSD为1.51%(n=6)。结论该方法简单、准确、灵敏，重现性好，适用于小儿退热口服液的质量控制。
【关键词】高效液相色谱法;小儿退热口服液;绿原酸;栀子苷;黄芩苷;丹皮酚
小儿退热口服液主要由大青叶、板蓝根、金银花、栀子、牡丹皮、黄芩、连翘、淡竹叶等十二味中药组成[1]，具有疏风解表、解毒利咽的功效，用于小儿外感风热所致的感冒[2]。其中金银花的主要药效活性成分为绿原酸，栀子的主要药效活性成分为栀子苷，牡丹皮的主要药效活性成分为丹皮酚，黄芩的主要药效活性成分为黄芩苷[3-6]。2015版《中国药典》分别对栀子苷和黄芩苷进行含量测定[7]，而对绿原酸和丹皮酚仅进行了薄层鉴别，对于小儿退热口服液的质量控制方法有待进一步提高。目前有报道分别测定不同制剂中绿原酸、丹皮酚、黄芩苷、栀子苷的含量[8-11]，但能够同时对这4种成分进行测定的报道较少，为进一步提高药品有效成分含量的稳定度，提高药品质量，本文通过HPLC梯度洗脱体系，同时测定样品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量，建立了小儿退热口服液中四种目标成分含量测定的HPLC方法。
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent1200高效液相色谱仪;Milli-QA超纯水器(Millipore)，METTLERTOLEDOXS205分析天平。
1.2试药
绿原酸对照品(批号：110753-201314)(中国药品生物制品检定所)、栀子苷对照品(批号：110749-200512)(中国药品生物制品检定所)、黄芩苷对照品(批号：110725-201321)(中国药品生物制品检定所)、丹皮酚对照品(批号：110708-200506)(中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯(默克公司)，蒸馏水，其余使用试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。小儿退热口服液(批号：14263934、15260262、14263933，厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司)。
2方法
2.1含量测定
色谱条件：色谱柱为WelchUltimateXB-C18(250mm×4.6mm，5μm);流动相：甲醇(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱(洗脱梯度见表1);检测波长：绿原酸为330nm，栀子苷为240nm，黄芩苷、丹皮酚为278nm;流速：1ml/min;柱温：30℃;进样量：10μl;理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5000，详见表1。
2.2对照品溶液制备
分别取绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚对照品适量，进行精密称定，用50%甲醇溶解，最后制备成每毫升含绿原酸10μg、栀子苷50μg、黄芩苷50μg、丹皮酚10μg的对照品溶液。
2.3供试品溶液制备
用移液管精密量取小儿退热口服液供试品1ml，倒入25ml容量瓶，用50%甲醇逐步适量稀释定容至所需刻度，充分摇匀，缓慢滤过，取续滤液，即得小儿退热口服液供试品溶液。
2.4阴性样品溶液制备
根据小儿退热口服液处方的比例制备缺乏绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚的阴性样品，将阴性样品按照“2.3”项下的制备方法配置成阴性样品溶液。
2.5标准曲线制备
分别精密量取绿原酸(0.03458mg/ml)、栀子苷(0.24312mg/ml)、黄芩苷(0.33967mg/ml)、丹皮酚(0.05036mg/ml)的对照品储备液0.1、0.2、0.5、1、2、5ml，置于10ml量瓶中，用50%甲醇逐步稀释至所需刻度，充分摇匀，分别精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚峰面积，以对照品峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。
3结果
3.1专属性试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定;图1结果显示：供试品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚色谱峰与其他杂质峰达到基线分离，表明阴性样品溶液无干扰。
3.2线性关系考察
按照方法项下2.5操作，线性范围与回归方程见表2。
3.3精密度试验
同一对照品溶液精密吸取10μl，连续重复进样6次，结果显示绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.43%、0.20%、0.42%和0.10%，表明本法精密度良好。
3.4稳定性试验
分别量取已制备的小儿退热口服液供试品溶液，室温放置，并于第0、2、4、8、12、24h进样来测定峰面积，结果显示绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚RSD分别为0.10%、0.69%、0.55%、1.24%，表明小儿退热口服液供试品溶液在24h内非常稳定。
3.5重现性试验
分别量取6份同一批样品(批号：15260262，厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司)，严格按照含量测定下方法对样品进行平行测定，结果为：绿原酸含量为0.3550mg/ml(RSD=0.52%)，栀子苷含量为1.8115mg/ml(RSD=1.12%)，黄芩苷含量为1.8516mg/ml(RSD=1.49%)，丹皮酚含量为0.1578mg/ml(RSD=0.49%)，表明该方法测量样品的重现性良好。
3.6回收率试验
用量筒精密量取已知含量的样品0.5ml(批号：15260262，厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司)，共取6份，分别精密加入对照品溶液(绿原酸0.1763mg/ml、栀子苷0.91115mg/ml、黄芩苷0.9167mg/ml、丹皮酚0.0724mg/ml)1ml，按照制备供试品溶液的方法进行制备，平行测定，计算回收率。结果见表3。
3.7样品含量量
取“2.3”项下3个批号的小儿退热口服液供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件分别进行测定，并记录峰面积，按外标法计算各批次样品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量。测定结果：批号为14263934、15260262、14263933的3批样品中绿原酸含量分别为0.2058mg/ml、0.3550mg/ml、0.2142mg/ml，栀子苷含量分别为1.5689mg/ml、1.8115mg/ml、1.6026mg/ml，黄芩苷含量分别为2.1586mg/ml、1.8516mg/ml、2.1780mg/ml，丹皮酚含量分别为0.2580mg/ml、0.1578mg/ml、0.2580mg/ml。
4讨论
4.1色谱条件的选择
丹皮酚和栀子苷一般采用甲醇-水体系进行分离系统，黄芩苷与绿原酸一般采用甲醇-磷酸缓冲盐体系进行分离。实验发现绿源酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚四种成分在甲醇-磷酸盐缓冲体系中均峰形良好。通过考察不同比例磷酸(0.1%、0.2%、0.3%，0.4%)，发现浓度为0.2%时峰形对称，理论塔板数较好。由于小儿退热口服液处方药味较多，成分比较复杂，黄芩苷与丹皮酚峰比较接近，较难分离，故采用梯度洗脱方法[12-13]。
4.2检测波长的确定
采用Agilent工作站的DAD检测器来进行全波长扫描，发现绿原酸在330nm，栀子苷在240nm，黄芩苷和丹皮酚在278nm波长处有最大吸收。故选择330nm测定绿原酸，240nm测定栀子苷，278nm测定丹皮酚。
4.3供试品制备
由于小儿退热口服液已经经过水提和醇提过程，且目标成分均为水溶性成分，只需要简单的稀释即可进行测定。实验证明此方法简单可靠，操作性高。
本实验结果表明本文建立的HPLC方法简单、准确、灵敏，重现性好，适用于小儿退热口服液的质量控制。
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