发布时间：2020-02-28所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 摘要背景：脂肪干细胞的提取及纯化流程尚未建立统一标准。最常用的纯化脂肪干细胞的方法是利用红细胞裂解液处理基质血管成分。但这一步骤是否对脂肪干细胞存在不良影响仍缺乏证据，是否有利于未来临床应用仍有待探讨。目的：比较氯化铵红细胞裂解液法和非裂
摘要背景：脂肪干细胞的提取及纯化流程尚未建立统一标准。最常用的纯化脂肪干细胞的方法是利用红细胞裂解液处理基质血管成分。但这一步骤是否对脂肪干细胞存在不良影响仍缺乏证据，是否有利于未来临床应用仍有待探讨。目的：比较氯化铵红细胞裂解液法和非裂解法提取脂肪干细胞的效率，并进一步比较两种方法提取脂肪干细胞的生物学特性。方法：收集吸脂手术患者脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶消化后，利用或不用氯化铵红细胞裂解液对基质血管成分进行纯化，MuseTM细胞状态分析仪对活细胞计数及活细胞比例评估;将基质血管成分接种后培养人脂肪干细胞至第2代，光学显微镜观察脂肪干细胞形态，流式细胞学分析脂肪干细胞表型，CCK-8法绘制细胞增殖曲线，成脂及成骨培养基诱导后油红O及茜素红染色法分别评估成脂、成骨分化能力。该实验经中国医学科学院整形外科医院伦理委员会批准，并与患者签署相关知情同意书。结果与结论：①与裂解组相比，非裂解组提取即刻的基质血管成分中非红活细胞数更多，活细胞百分比更大;②两组脂肪干细胞均呈梭形、鱼群状排列;③两组细胞均高表达CD90、CD73、CD105等细胞表面抗原，低表达或不表达CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR等细胞表面抗原;④非裂解组细胞增殖速度更快，成脂及成骨能力两组间无明显区别;⑤结果表明，利用氯化铵红细胞裂解液法提取基质血管成分降低了脂肪干细胞提取效率，抑制了脂肪干细胞增殖能力。非裂解过程不影响脂肪干细胞表型及成脂、成骨分化能力。因此不建议在人脂肪干细胞提取过程中进行氯化铵法红细胞裂解。
关键词：红细胞裂解液;细胞提取;脂肪干细胞;细胞活性;细胞表型;细胞增殖
0引言Introduction脂肪干细胞是一群从脂肪组织中获取的中胚层来源的多能成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能[1]，其获取方法微创，组织来源丰富，具有重要的临床应用价值[2-3]。然而，目前体外扩增脂肪干细胞的方法还有待标准化，如培养基使用种类、细胞接种密度等[4]，这成为学者们不断研究的方向[5]。
相关期刊推荐：《中国组织工程研究》杂于1997年创办，发表组织工程研究中关于干细胞培养与移植、组织构建、材料生物相容性评价(天然或合成材料与纳米粒子、人工材料植入体、植入器官及外源性细胞)、计算机辅助骨外科技术的应用基础及临床研究，转化医学和循证医学研究的文章，发表中国组织工程研究领域一流水平的学术、技术创新成果。
目前在提取脂肪干细胞的过程中多包含红细胞裂解步骤[1，6-7]，其目的是纯化细胞组分，便于原代脂肪干细胞提取。含有氯化铵的红细胞裂解液可能具有潜在毒性，目前尚无临床级的脂肪干细胞裂解液[8]。红细胞裂解过程是否影响脂肪干细胞活力、表型、增殖及分化能力，目前相关研究较少。该研究旨在探讨利用红细胞裂解液提取脂肪干细胞是否为必要步骤，以优化人脂肪干细胞提取过程。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计细胞生物学对比观察。
1.2时间及地点2018年2月至2019年5月在中国医学科学院整形外科医院研究中心完成。
1.3材料
1.3.1脂肪组织实验所用脂肪组织取自中国医学科学院整形外科医院行吸脂手术的9名患者，均为女性，年龄25-39岁，中位年龄32岁，体质量指数18.59-24.98kg/m2，见表1。无全身代谢及内分泌疾病，无肿瘤病史及肿瘤家族史，无酗酒及吸烟史，无服用利尿剂等影响糖类脂类代谢药物史。实验经中国医学科学院整形外科医院伦理委员会批准，并与患者签署相关知情同意书。
1.3.2实验试剂及仪器胎牛血清(Gibco公司);Ⅰ型胶原酶(Sigma公司);青链霉素、DMEM低糖培养基(Hyclone公司);红细胞裂解液、HumanMSCAnalysisKit(BD公司);MuseTMcellanalyzer(Millipore公司);流式细胞仪(BD公司);CCK-8(碧云天公司);人脂肪间充质干细胞成脂诱导培养基、人脂肪间充质干细胞成骨诱导培养基(Cyagen公司);倒置相差显微镜(Olympus公司);酶标仪(EnSpire公司)。
1.4实验方法
1.4.1分离细胞基质成分无菌条件下获取脂肪抽吸物，每例吸脂脂肪标本均在获取后12h内进行基质血管成分的提取操作。将人脂肪抽吸物用DPBS清洗，1000r/min离心5min后去除上层油层及下层液体层，留取中间脂肪层，记录剩余脂肪组织的体积。将每例脂肪样本均分2份，每份20mL，于终质量浓度为0.01g/L的Ⅰ型胶原酶中37℃摇床(100r/min)消化1h，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM低糖培养基以中和胶原酶的作用，1200r/min离心10min，弃上清。非裂解组加入20mL低糖DMEM培养基重悬细胞，涡旋均匀后室温放置15min，100目滤网过滤，加入20mL低糖DMEM培养基1000r/min离心5min，弃上清，该步骤重复2次后加入低糖DMEM培养基重悬细胞制备细胞悬液。裂解组采用20mL1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋均匀后室温放置15min，此后步骤同非裂解组。采用MuseTM细胞状态分析仪计数悬液中活细胞百分比及活细胞数。将细胞悬液分装入75cm2培养瓶，于37℃、体积分数为5%CO2条件下培养。待细胞80%融合后，TrypLETMExpress进行消化，以1∶2比例传代。来自不同供体的第2代细胞进行各项分析。
1.4.2基质血管成分细胞计数及活细胞百分比测定提取即刻基质血管成分细胞悬液，利用MuseTM计数和活力试剂盒分析活死细胞。简言之，取20μL细胞悬液，加于380μLMuseTM细胞计数和活力检测试剂，吹打均匀，室温避光放置5min。设置仪器稀释系数为1∶20，用MuseTM细胞状态分析仪对基质血管成分细胞悬液中活细胞数及活细胞百分比进行检测。
1.4.3细胞表型检测利用人间充质干细胞表型检测试剂盒对以下表面标记进行检测：CD90、CD44、CD105、CD73、CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR。利用人间充质干细胞表型检测试剂盒对如上标记进行检测。取第2代脂肪干细胞，消化后制成单细胞悬液，调细胞浓度为1×106L-1。取1mL单细胞悬液置于1.5mLEP管中，1000r/min离心5min，弃上清后加入100μLDPBS缓慢吹打、重悬细胞，按照说明书在不同的EP管加入鼠抗人抗体，4℃避光孵育30min，1000r/min离心5min后弃上清，DPBS冲洗并再次离心后吸净上清，用500μLDPBS重悬细胞，加入40g/L多聚甲醛溶液固定细胞。使用BD流式细胞仪分析细胞表型，FlowJo软件对所得数据进行分析。
1.4.4CCK-8法绘制细胞增殖曲线取第2代脂肪干细胞，消化后制成单细胞悬液，以每孔2000个细胞密度接种于96孔培养板，每孔加入100μL细胞悬液。依据培养时间设24个复孔，另外再设置8个空白调零孔(无细胞，只加入等量完全培养基)，放入细胞培养箱内预培养。配置CCK-8、培养基混合液，体积比为1∶10，分别于第0-7天轻轻吸取设定孔内上清液100μL，向孔内加入CCK-8、培养基混合液110μL，轻柔水平振荡混匀，放入培养箱孵育4h。用酶标仪测定波长450nm处各孔吸光度，复孔读数(平均值)与调零孔读数(平均值)的差值即为最终吸光度值;根据每个时间点的最终吸光度值绘制细胞增殖曲线。
1.4.5脂肪干细胞成脂诱导及油红O染色第2代脂肪干细胞消化重悬后计数，以2×104个/cm2细胞密度接种于6孔板，每孔加入2mL细胞悬液。当细胞汇合达到80%时，开始更换成脂诱导培养基。根据赛业人脂肪间充质干细胞成脂诱导试剂盒说明书进行成脂诱导，持续诱导9d，进行油红O染色：吸去培养皿中成脂诱导培养基，DPBS轻轻漂洗2次，40g/L多聚甲醛室温固定30min;吸除多聚甲醛，DPBS漂洗3次，每孔加入油红O工作液1mL，37℃孵育30min;吸除油红O工作液，DPBS漂洗2次，在相差倒置显微镜下进行观察和图像采集。Imagepro软件分析成脂水平。
1.4.6脂肪干细胞成骨诱导及茜素红染色第2代脂肪干细胞消化重悬后计数，以2×104个/cm2细胞密度接种于6孔板，每孔加入2mL细胞悬液。当细胞汇合达到80%时，开始更换成骨诱导培养基。根据赛业人脂肪间充质干细胞成骨诱导试剂盒说明书进行成骨诱导，每隔3d换液1次，持续诱导14d，进行茜素红染色：吸去培养皿中成骨诱导培养基，DPBS轻轻漂洗2次，40g/L多聚甲醛室温固定30min;吸除多聚甲醛，DPBS漂洗3次，每孔加入1mL茜素红染液，37℃孵育5min，吸除茜素红染液，DPBS漂洗2次，在相差倒置显微镜下进行观察和图像采集。Imagepro软件分析成骨水平。
1.5主要观察指标①基质血管成分中活细胞浓度及百分比;②脂肪干细胞表型;③脂肪干细胞增殖能力;④脂肪干细胞成脂、成骨分化能力。
1.6统计学分析采用SPSS23.0及GraphPadPrism8医学统计软件进行分析，计量资料以x_±s表示，进行配对t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
2结果Results
2.1非裂解组提取即刻活细胞数及活细胞比率优于裂解组为了验证MuseTM细胞状态分析仪是否可以排除非裂解组基质血管成分中的红细胞，将裂解组的细胞门应用于非裂解组进行细胞计数，即获得非裂解组的非红细胞活细胞数;重新上样后重新对非裂解组设门，再次进行非裂解组的细胞计数及活力分析;将两个门获得的活细胞数进行比较。经配对t检验，两组活细胞数：应用非裂解组门计数得到细胞浓度为(4.25±2.55)×109L-1，应用裂解组门计数得到细胞浓度为(4.17±2.52)×109L-1，P=0.921，差异无显著性意义，即提示MuseTM细胞状态分析仪可对非裂解组细胞进行非红细胞计数，见表2。进一步比较非裂解组与裂解组提取即刻细胞计数与活力，经配对t检验，非裂解组细胞数量为(5.59±2.47)×109L-1，裂解组细胞数量为(1.86±1.01)×109L-1，差异有显著性意义(P=0.001)，非裂解组基质血管成分提取即刻活细胞数更多，见表2。非裂解组细胞活力百分比为(65.91±3.47)%，裂解组细胞活力百分比为(60.20±5.13)%，差异有显著性意义(P=0.019)，见表2及图1。
2.2原代培养人脂肪间充质干细胞形态原代细胞为梭形，可见混杂非梭形贴壁细胞，见图2A。第2代脂肪干细胞几乎完全呈长梭形生长，呈鱼群状排列，见图2B。
2.3第2代脂肪干细胞表型根据流式细胞仪检测结果，CD90、CD73、CD105等细胞表面抗原标记物呈现高表达，CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR等细胞表面抗原标记物呈现低表达或无表达，两组细胞间表面抗原比例差异无显著性意义，见图3。
2.4两组脂肪干细胞的增殖能力裂解组与非裂解组第2代人脂肪干细胞的增殖曲线均为近弧形,形态近似度高;接种后第7天，非裂解组吸光度值为0.70±0.19，裂解组吸光度值为0.66±0.19，两组差异有显著性意义(P=0.03)，见表2及图4。
2.5两组脂肪干细胞体外成脂分化能力相似将裂解组与非裂解组第2代人脂肪干细胞在体外进行成脂诱导分化，诱导第9天进行油红O染色。非裂解组样本弥散分布的红色油滴更为明显，染色结果行Imagepro半定量检测(累积光密度值)：非裂解组为11350.00±3776.32;裂解组为11912.17±3324.47，差异无显著性意义(P=0.79)，见表2及图5。
2.6两组脂肪干细胞体外成骨分化能力相似将裂解组与非裂解组第2代人脂肪干细胞在体外进行成骨诱导分化，诱导第14天进行茜素红染色，两组均可见弥散分布的红色结节。染色结果行Imagepro半定量检测(累积光密度值)：非裂解组为2846018.4±1993818.0，裂解组为2568546.0±2866366.2，差异无显著性意义(P=0.86)，见表2及图6。
3讨论Discussion
脂肪干细胞由于产量高、容易获取，是代替骨髓干细胞的重要干细胞来源[8]。人脂肪干细胞治疗慢性溃疡等已在许多临床研究中报道[9-10]，此外其具有治疗糖尿病、心血管疾病、瘢痕的潜能[11-13]。目前提取脂肪干细胞的过程主要步骤分为脂肪处理、胶原酶消化、终止消化、红细胞裂解等步骤[6]。为了使人脂肪干细胞能够进行临床应用，在整个分离、扩增和移植过程中应遵循良好生产规范(GMP)指导原则[14]
裂解红细胞的主要目的是纯化混杂的基质血管成分细胞团，去除其中的红细胞，以便于细胞贴壁后获得相对同质的细胞群[15]。在细胞提取过程中常用含有氯化铵成分的红细胞裂解液[16-18]，其作用机制为红细胞内有大量的碳酸酐酶，可以自发将NH3转化为NH4+，CO2转化为HCO3-，促使胞外NH3和CO2连续内流而造成细胞裂解[15]。然而，目前尚无临床级的红细胞裂解液，此外脂肪组织内并无大量血液成分。因而红细胞裂解步骤是否必要、无裂解步骤是否影响脂肪干细胞生物学特性仍有待探讨。
该研究发现，提取基质血管成分即刻非裂解组活细胞数及活细胞比例优于裂解组，提示裂解液成分可能对有核细胞的活性存在不良影响，从而导致了裂解组活细胞数及比例均较非裂解组低;CCK-8细胞增殖实验结果显示第2代细胞接种7d后，裂解组细胞增殖能力显著低于非裂解组，提示对于氯化铵裂解处理存活下来的脂肪干细胞，到第2代其生长增殖能力仍然受到不可逆影响。氨的神经毒性已经被广泛研究，被认为是肝性脑病的最关键原因，其毒性作用包括直接毒性、氧化应激、谷氨酰胺水平变化导致能量代谢障碍等[19]。WANG等[20]在体外应用氯化铵处理模拟高氨血症培养肝细胞，发现氯化铵抑制肝细胞生长、诱导细胞凋亡、造成线粒体通透性转换孔(mPTP)长时间开放引起线粒体肿胀损伤，并影响细胞三羧酸循环能量代谢造成ATP产生降低等，表明其对肝细胞亦存在细胞毒性。LI等[21]分别应用155mmol/L氯化铵及0.3%低渗氯化钠提取出的第4代人脂肪间充质干细胞生物学特性进行研究，发现155mmol/L氯化铵裂解组提取出的人脂肪间充质干细胞增殖能力明显低于0.3%低渗氯化钠。尽管不同细胞品系对氯化铵毒性反应有所不同[22]，通过该研究初步实验结果，有理由推测氯化铵裂解步骤可能通过同样机制影响脂肪干细胞的活性及增殖能力，确切的机制有待进行深入研究。
该研究还发现脂肪干细胞表型和分化能力在裂解组和非裂解组中并无差异，这与LI等[21]的实验结果一致。学者们对裂解法提取骨髓或脐血来源干细胞进行了诸多研究，多不影响细胞表型。研究表明，红细胞裂解法制备骨髓间充质干细胞不影响细胞表型及成脂成骨分化能力，且较密度离心法更易于标准化[15]。最近有作者分析了渗透筛选是否可用于从脐血中提取人间充质干细胞，结果证明了间充质干细胞可用此方法进行筛选而不影响细胞表型[23]。此外，在脂肪干细胞成脂及成骨分化方面，裂解组虽然显示了较低的分化水平，但两组之间差异无显著性意义，作者推测短时间内裂解液对细胞膜的影响尚未引起分化相关基因及蛋白的表达，其机制仍有待于进一步探讨。
该研究比较了氯化铵红细胞裂解液法和非裂解法提取的脂肪干细胞的生物学特性的差异，并提供了令人信服的证据说明后者可能是一种更有效的方法，其可以更有效地获取人脂肪干细胞，更好地保留细胞增殖能力，并不影响细胞表型及细胞成脂、成骨分化能力。目前，非裂解法获取人脂肪间充质干细胞更有利于临床应用，对细胞活力及增殖能力影响更低的新型红细胞裂解液有待研发。
SCISSCIAHCI
