发布时间：2020-04-01所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 摘要目的确定以大肠杆菌表达丁肝抗原的最佳条件，为规模生产以求研发丁肝ELISA诊断试剂奠定基
摘要目的确定以大肠杆菌表达丁肝抗原的最佳条件，为规模生产以求研发丁肝ELISA诊断试剂奠定基础。方法在不同温度、时间、IPTG和菌种浓度条件下，分别进行蛋白表达，取等体积样本进行SDS—PAGE电泳，经ImageLab软件分析，比较目的蛋白表达量，确定最佳表达条件。结果在25℃、29~C、33oC和37~C条件下，蛋白表达量无统计意义的差别;在添加IPTG后的1、2、3、4、5和6h，表达量无统计意义的差别;在以0.25、0.5、1、2和4mmol/LIPTG诱导时，表达量无统计意义的差别。当添加诱导剂前，菌种的ODo。值分别为1.236、0.772、0.542和0.384，目的蛋白表达量有显著意义的差别。以OD值为1.236和0.772时，表达量最高，两者之间无统计意义的差别;OD。。值为0.542时，表达量次之;OD。。值为0.384时，表达量最低。结论温度、表达时间和IPTG浓度在一定范围内对丁肝抗原蛋白表达量无影响;菌种的浓度是影响蛋白表达量的决定性因素;当菌种浓度在OD值约为0.7～1.2时，以0.25mmol/LIPTG在37℃，诱导表达1h为最佳表达条件。该条件下，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的41.5%。
关键词丁肝基因工程抗原表达
丁型肝炎病毒(HDV)是一种缺陷型负链RNA病毒，需依赖乙型肝炎病毒(HBV)或其他嗜肝DNA病毒的帮助才能复制和传播¨。HDV与HBV同时或重叠感染，可造成原有病情加重，或发展成为肝硬化甚至暴发性肝炎。我国是乙型病毒性肝炎的高流行区，当前乙型肝炎病毒表面抗原(HBAg)的阳性率仍大于8%E33，这说明丁型肝炎作为依托乙型肝炎病毒感染的疾病，仍严重威胁着我国人民的健康。只有对丁型肝炎及时准确的诊断，才能为其治疗和防控工作奠定基础。以酶联免疫吸附实验(ELISA)测定丁肝抗原或抗体是诊断丁肝的主要手段。为提高和改进我国当前HDVELISA诊断试剂的质量，大量获取高纯度、好活性的丁肝抗原是进一步开展研发工作的首要条件。本文从不同角度探讨温度、时间、诱导剂和菌种浓度等对丁肝抗原表达量的影响，从而确定其表达的最佳条件，为批量生产奠定基础。
材料与方法
1.材料：丁肝抗原优化基因由北京六合通公司合成;表达载体M48由本室从商品化质粒PET43a改造并留存;BL21感受态(北京六合通公司);LB培养基(美国，Sigma);TZ一2H台式恒温振荡培养箱(北京沃德创新医药科技中心);垂直电泳系统(美国，Bio—rad);蛋白彩色Marker(纽英伦生物技术北京有限公司);蛋白Marker(中国科学院上海生命科学研究院);GelDocXR+凝胶成像系统和ImageLab分析软件(美·32·国，Bio—rad);H一15FR低温离心机(美国，KOKUSAN);GGT一900超净工作台(北京半导体设备一厂);XMTD一6000电热恒温水槽(北京市长风仪器仪表公司);酶标仪(美国，Ther—mo)。
2.方法：(1)菌种的培养：将含丁肝抗原优化基因的M48质粒，常规转化BL21感受态，挑取单斑菌，接种于1.5ml含100IXg/mlAmp的LB培养基中，37℃，240r/min，振荡培养3h;再取该菌按1：100接种于3ml含100ixg/mlAmp的LB培养基中，37℃，240r/min，振荡培养2h;再取该菌按1：1000分别接种于2.4L含100p~g/mlAmp的LB培养基中，30~C，240r/min，振荡培养过夜;以含100Ixg/mlAmp的LB培养基做倍比稀释，37℃，240r/min，振荡培养1h后，作为测定不同温度、时间和IPTG浓度对蛋白表达量影响的实验用菌种。不同菌种浓度对蛋白表达量影响的实验用菌，视过夜菌梯度稀释后，在37oC，240r/min，振荡培养过程中的OD值而采集。(2)不同条件下的蛋白表达：取lOOml的三角瓶，分装30ml上述菌种，分别添加IPTG至终浓度为0.25、0.5、1、2、4mmol/L，同时设不加IPTG的对照，再依次分别置于25℃、29℃、33℃和37℃的恒温震荡培养箱内，240r/min，震荡培养，每种不同条件的样本均设3例。于培养1、2、3、4、5和6h时，以EP管分别取样500IXl，lO000r/min，离心1min，弃上清，一20℃冻存备检。(3)电泳：将上述样本以5O1双蒸水充分重悬，再加等体积2×Bufer，混匀，煮沸3min，取样2Ol，以5%浓缩胶和13%分离胶进行常规SDS—PAGE。(4)软件分析：以GelDocXR+凝胶成像拍照，留存;用ImageLab软件对蛋白条带进行分析。
结果
1.不同诱导剂浓度条件下蛋白表达结果：在IPTG浓度分别为0.25、0.5、1、2、4mmol/L的条件下，均有分子质量约为35kDa的外源性蛋白表达;且经ImageLab软件分析，其表达量无统计意义的差别，如图1示。
2.不同温度条件下蛋白表达结果：在25℃、
29℃、33℃和37℃条件下，均有分子质量约为35kDa的外源性蛋白表达;且经ImageLab分析，其表达量无统计意义的差别，如图2示。
3.不同表达时间蛋白表达结果：当表达时间分别l、2、3、4、5和6h时，均有分子量质约为35kDa的卜源性蛋白表达;且经ImageLab分析，其表达量无计意义的差别，如图3示。
4.不同菌种浓度蛋白表达结果：诱导不同浓度的菌种，均有分子质量约为35kDa的外源性蛋白表达;经lmageLab分析，其表达量有统计意义的差别。在0Dn为1.236和0.772时，表达量最高，且两者之间无统计意义的差别;ODomm为0.542时，表达量次之;ODo值为0.384时，表达量最低，如图4示。
5.目的蛋白的含量：以lmageLab对表达产物进行定量分析，第6峰为目的蛋白(图5)，约占菌体总蛋白的41.5%。
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讨论
目前，大肠杆菌已成为现代分子生物学研究中最常用的材料之一，广泛用于外源蛋白的原核表达。外源蛋白在大肠杆菌中的表达受多种因素的影响(5-]。
主要有外源基因的结构，表达载体和宿主菌的选择，表达条件及营养状况等。因此，对不同的基因必须对诱导条件进行优化，寻找适宜的表达条件，才能获得最大程度的表达。
当异源目的基因的mRNA在大肠杆菌中过表达时，tRNA的数量直接反映了mRNA的密码子偏倚性[。不充足的1RNA库可能导致翻译延迟、成熟前翻译终止、翻译移码和氨基酸错配。尽管少量稀有密码子的出现通常不会给目的蛋白的合成造成太大影响，不过如果一个基因中含有成串或多个大肠杆菌稀有密码子，外源蛋白的表达将非常低¨。为此，本研究所用基因采用人工编码，选用大肠杆菌的高频密码子，避免因tRNA的稀有或缺少而导致的翻译停止。汤少华等报道，丁肝病毒抗原蛋白编码区约230bp的基因表达即可获得有效的抗原蛋白，本研究所用基因优化后为596bp，所获蛋白具有良好的抗原性(具体结果另文发表)。
本实验选用含硫氧还蛋白的M48(系本室由PET43a改造而来)融合蛋白表达系统，借助硫氧还蛋白分子伴侣的作用¨，表达出的蛋白既能正确折叠又能表现出全部生物学活性。M48载体多克隆酶切位点的上游插入有编码6个组氨酸的序列，可与目的蛋白融合表达，利用6xHisTag和金属镍的亲和力所产生的螯合作用而设计的亲和层析方法，可以有效纯化此蛋白;同时，M48含T7强启动子，该启动子对T7RNA聚合酶启动转录具有特异性，不仅转录效率高而且转录物完整，保证了表达rHDAg的完整性和高效性。
一般认为，温度是影响蛋白表达的重要因素，温度越高，蛋白表达量越大，且易形成包涵体’”’。本研究其他实验已证实，此蛋白37℃表达依然可溶(结果另文发表)。本实验进一步证实，在一定范围内，温度变化对其表达量无明显影响。因37℃是大肠杆菌的最适生长温度，所以确定在37℃进行表达。
蛋白表达时间一直是备受关注的问题，时间太短表达量少;时间长了又因蛋白酶的释放而降解。因本研究采用BL21作为表达菌株，其蛋白酶含量极少，使表达蛋白不致被水解，为表达蛋白的稳定性提供了可靠保障。经本实验证实，表达时间在一定范围内对蛋白表达量无影响。
诱导剂IPTG是B一半乳糖苷酶底物的类似物，可与阻遏蛋白结合成复合物，使阻遏蛋白构象发生改变，不能与O基因结合，从而促进基因表达。因IPTG有潜在毒性，且价格昂贵，并不是表达蛋白的理想诱导物，目前因尚未找到合适替代品而沿用，但求用量减少。本实验结果与相关研究一致，一定范围内，增大IPTG的浓度并不能增加蛋白表达量¨。0.25mmol/L是不影响蛋白表达量的最低浓度。
本研究证实，诱导时的菌种浓度是决定蛋白表达量的主要因素。当OD为0.772时，诱导比较合适，细菌处于对数生长期，利于可溶性表达，且表达出的目的蛋白占菌体总蛋白的比例最高，约占41.5%。最终确定，当菌种生长至OD。。约为0.7时，以0.25mmol/LIPTG在37℃诱导1h为最佳表达条件，为丁肝抗原的大量表达奠定了实验基础。
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