发布时间：2020-04-08所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： [摘要]目的：观察旋毛虫(spiralis)感染对小鼠结肠上皮通透性的影响及其作用机制。方法：spiralis感染BALB/c小鼠。7d后直肠灌注辣根过氧化物酶(HRP)，在其后的0min、60min、120min，分别检测小鼠血液中HRP的情况，尾静脉采血检测ISG和IsG，随后处死小鼠，以EL
[摘要]目的：观察旋毛虫(spiralis)感染对小鼠结肠上皮通透性的影响及其作用机制。方法：spiralis感染BALB/c小鼠。7d后直肠灌注辣根过氧化物酶(HRP)，在其后的0min、60min、120min，分别检测小鼠血液中HRP的情况，尾静脉采血检测ISG和IsG，随后处死小鼠，以ELISA法和流式细胞术检测肠系膜淋巴结中白细胞介素4(IL一4)的表达。另外，以spiralis感染STAT6敲除小鼠，同前法一样操作，观察相同指标。结果：spiralis感染组结肠通透性明显增加，IL一4和IsGl明显增高，IsG2。明显降低(均P<0.05)。STAT6敲除小鼠实验，spira一感染并未导致结肠通透性的增加(P>0.05);与BALB/c感染组小鼠相比，STAT6敲除感染组小鼠IL一4明显较低(P<0.05)。结论：spiralis感染能够导致小鼠结肠上皮通透性的增加，其作用机制可能是通过诱导IL一4的分泌来实现的。
[关键词]旋毛虫;结肠上皮;白细胞介素
有研究报道，巴西钩虫(Nippostrongylusbrasilien—s)感染导致肠道E—cadherin的表达改变，导致小肠上皮细胞的附着力损失;而多形螺旋线虫(一ligmosomoidespolygyrus)感染导致小肠上皮通透性增加_2J。但肠道蠕虫感染及其诱导的Th2反应对结肠上皮通透性影响的相关研究较少见。目前还不清楚蠕虫感染是否可引起结肠上皮通透性改变和如何影响结肠上皮通透性。本文旨在观察旋毛虫对肠道黏膜通透性影响，并初步探讨其机制。
材料和方法
1动物及分组
选择6到8周大的雌性BALB/c小鼠(SPF级)，以高压蒸汽消毒的食物和水喂养。将BALB/c鼠随机分为2组，即spiralu感染组(BALB/c+T.S组)和无spiral~感染组(对照组，BALB/c组)。每只小鼠经口服喂养spiralis幼虫400条(幼虫配成悬液喂养，并以显微镜鉴定为活虫)。
2结肠通透性的分析
小鼠感染spiralis7d后，直肠内给予辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP;Sigma)，然后测量血液中HRP浓度判定结肠通透性。在小鼠禁食12h之后，以2%戊巴比妥钠麻醉(50mg/kg)，50辣根过氧化物酶(含0.6mg)以针头经直肠注人。辣根过氧化物酶灌注后的0(即为未灌注HRP的时点)、6o和120min后，从尾静脉收集血液样本，采用EUSA法测定血清辣根过氧化物酶浓度。
3血清IgGl和IgG2。的检测
将上述尾静脉收集的血液样本，以ELISA法检测IgG1和IgG2的表达量。
4淋巴细胞细胞因子ELISA检测
spiralis感染7d后，处死小鼠。所有小鼠经断颈法处死。打开腹腔，取出肠系膜淋巴结(mesentericlymphnode，MLN)。将外周淋巴结分组研磨(溶液为cDMEM)，用70m的滤器过滤，4oC、1500r/min离心8min，弃除上清，加入2mLcDMEM溶液，将细胞振荡溶解，将之调成5×10/L。加CD3单克隆抗体孵育，置于CO培养箱内，5%C0、37℃静置培养72h，收集培养液上清，置于一20℃冻存。以ELISA法检测Th2细胞因子白细胞介素4(interleukin一4，IL一4)的表达量。
5信号转导子与转录激活子6(signaltransducerandactivatoroftranscription6。STAT6)基因敲除小鼠实验
选6—8周雌性基因敲除小鼠(SPF级，BALB/c背景，购于美国杰克森实验室)。将小鼠分为3组，STAT6敲除小鼠组(无spiralis感染，STAT6组)、BALB/c小鼠感染组(BALB/c+T.S组)和STAT6敲除小鼠感染组(STAT6+T.S组)，spiralis感染小鼠7d后，先行尾静脉取血1次(在实验结果中标示为0min)，然后以HRP经直肠注人，辣根过氧化物酶灌注后60和120min'~，从尾静脉收集血液样本，采用ELISA法测定血清辣根过氧化物酶浓度，以此来判定结肠上皮通透性。处死小鼠，取出肠系膜淋巴结，制作淋巴细胞悬液，加CD3单克隆抗体孵育72h。收集上清，ELISA法检测细胞因子的变化。
6统计学处理
数据用均数±标准差(露±s)表示，采用Graph—PadPrism统计学软件处理，进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
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结果
1spiralis感染导致结肠上皮通透性变化
对照组小鼠血清的辣根过氧化物酶量很少。蠕虫感染的小鼠血清辣根过氧化物酶水平显著增高(HRP处理60min后)。结果表明肠道寄生虫感染后结肠上皮通透性显著增加，见图1。
2血清IgG。和IgG2。的检测结果
与无感染组比较，T.S感染组IgG。表达明显增高，IgG：表达明显降低，见图2。
3肠系膜淋巴结细胞因子ELISA检测结果
加CD3单克隆抗体刺激，无感染组IL一4(21.0±2.3)g/L，感染组IL一4(193.0±12.5)g/L，感染组IL一4的表达明显增高，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
4STAT6敲除小鼠蠕虫感染不能改变结肠上皮通透性
BALB/c小鼠感染后血清辣根过氧化物酶水平显着增加，有蠕虫感染和无感染的STAT6敲除小鼠血清辣根过氧化物酶量无显著差异，见图4。
5STAT6敲除小鼠肠系膜淋巴结几一4的变化
加CD3单克隆抗体刺激，BALB/c+T.S组IL一4(193.0±12.5)g/L，STAT6+T.S组IL一4(15.0.4-3.1)g/L，STAT6组IL一4(3.0±1.2)g/L，BALB/c+T.S组与STAT6+T.s组IL一4表达量比较，BALB/c+T.S组表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。
讨论
我们的结果表明，在野生型BALB/C小鼠中，小肠spiralis感染能够导致结肠上皮通透性增加，但在Th2缺陷的STAT6一小鼠中没有出现这种情况。这些结果表明，机制之一可能是旋毛虫感染影响了STAT6信号通路，从而改变结肠上皮屏障功能。
大分子HRP标记探针技术已广泛用于测量肠上皮细胞运输能力。通常情况下，肠腔可溶性抗原通过以下2条路线进行转运：经细胞途径或通过细胞间途径。经细胞的通透性对大分子通过上皮细胞的转运是一个重要的途径，有助于调节免疫激活。有研究显示，肠道蠕虫感染增加了肠道细菌易位和细菌脂多糖吸收加人门静脉循环，从而改变屏障功能,IL一4通过改变细胞间黏附分子明显增强了高分子通透性。
spiralis主要寄生在肠道小肠，而我们观察的是结肠上皮屏障功能的影响。因此，结肠上皮屏障功能改变与旋毛虫直接导致的机械性损伤无关。在本研究中，我们用Th2缺陷STAT6敲除小鼠测试小肠蠕虫是否通过蠕虫引起的自适应免疫激活间接影响结肠上皮屏障功能。我们结果表明，在BALB/c鼠中，旋毛虫感染导致了小鼠结肠上皮通透性增加，但是在Th2缺陷STAT6敲除小鼠中，印感染却没有出现这种情况，小鼠结肠通透性并没有因spiralis感染而增加。这些结果充分表明淋巴细胞活化、尤其是Th2细胞的活化，在肠道蠕虫感染中改变了肠道屏障作用。
Th2细胞因子IL一4和IL一13能够通过STAT6或磷酸肌醇3一激酶(PDK)途径影响它们靶细胞的激活。此前，Ceponis等使用T84细胞(人类结肠上皮细胞模型)研究IL一4和IL一13参与调节上皮通透性信号转导通路，认为PDK是IL一4和IL一13调节跨上皮电阻(TER)的主要近端信号途径。但是，最近的研究表明，Th2(IL—l3)依赖的屏障调控并不需要PI3K参与，但可能涉及STAT6，IL一13作为STAT6的抑制剂，不能抑制PDK，但能避免IL一13诱导的TER损失。我们研究显示，spiralis感染在STAT6敲除小鼠中未能改变结肠上皮通透性，这个结果支持了蠕虫感染时STAT6在调节过程中的肠上皮屏障功能的作用。这些结果进一步提示STArI’6信号通路和Th2免疫反应在调节肠道黏膜屏障中的作用。
总之，我们的研究表明，蠕虫感染能导致结肠上皮完整性和肠道上皮屏障功能的改变，而在其中一个潜在的机制可能是蠕虫感染诱导的肠道黏膜上淋巴细胞诱导产生的Th2反应参与造成的。以前研究均提示-8。。，蠕虫感染中肠道黏膜免疫反应的调节涉及多种作用机制，包括先天性和适应性免疫系统效应细胞的调节。对蠕虫免疫调节作用机制更深一步的了解，不仅将为免疫介导的疾病建立新颖和更有效的治疗方法，而且还能为慢性肠道蠕虫感染严重地区的微生物疾病预防和治疗设计有效肠道疫苗。
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