发布时间：2021-09-27所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 摘要：采用高效液相色谱法同时测定小叶丁香中4种具有保肝护肝作用的活性成分，为小叶丁香作为畜禽饲料开发利用提供依据。将干燥的小叶丁香茎叶部位粉碎，用950mL/L乙醇超声提取，浓缩，甲醇溶解，离心取上清液经微孔滤膜过滤，以乙腈-1mL/L醋酸水溶液为流动
摘要：采用高效液相色谱法同时测定小叶丁香中4种具有保肝护肝作用的活性成分，为小叶丁香作为畜禽饲料开发利用提供依据。将干燥的小叶丁香茎叶部位粉碎，用950mL/L乙醇超声提取，浓缩，甲醇溶解，离心取上清液经微孔滤膜过滤，以乙腈-1mL/L醋酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，在254nm和330nm双波长下测定，分析小叶丁香中橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B的含量。数据显示，松果菊苷在5μg/mL～80μg/mL，橄榄苦苷在50μg/mL～800μg/mL，紫丁香苷和连翘酯苷B在50μg/mL～1000μg/mL浓度范围内线性关系良好，平均加样回收率为95.2%～99.4%，相对标准偏差介于1.73%～2.83%。该方法前处理简单，灵敏，重复性良好。经测定，小叶丁香茎叶中橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B的平均含量分别为0.709%、0.452%、0.059%和0.512%。
关键词：小叶丁香;高效液相色谱;护肝;活性成分
肝脏是动物体内重要的解毒和代谢器官。由于抗生素等药物滥用，饲料霉变，细菌、病毒或寄生虫侵染以及环境污染等影响，畜禽在大规模养殖过程中极易造成肝脏损伤，引发肝脏疾病。这极大影响了畜禽养殖的生产性能和经济效益，亟需科技工作者研究解决。
近年来，发酵中药或中草药添加剂已在畜牧养殖中广泛应用，具有低耐药性、低药物残留，对动物、人类和自然环境不良影响较小等优势[1-2]。小叶丁香(SyringamicrophyllaDiels，SMD)为木樨科丁香属植物，又名四季丁香、二度梅和野丁香等，主要分布于我国河南、河北、陕西等地[3]，在我国北方作为观赏性园林植物广泛应用，民间用其花、果实等泡茶饮用，具有消炎、镇咳、治疗肝炎和肝硬化之疗效。小叶丁香富含糖苷类活性化合物，主要有以紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B等为主的苯乙醇苷类，以橄榄苦苷为主的裂环环烯醚萜苷类和黄酮苷类等[4-7]。现代药理研究表明，橄榄苦苷和紫丁香苷具有较好的肝细胞保护作用[8]。橄榄苦苷对脂多糖和四氯化碳诱导的小鼠肝损伤均有显著的保护作用，其作用机制可能与阻止肝脏炎性反应有关[9-10]。紫丁香苷则是一种强抗肝毒药物，可通过恢复微粒体酶系统的酶活性和抑制脂质过氧化作用促进肝毒物代谢并改善肝功能。松果菊苷可提高肝损伤小鼠的存活率、降低ALT水平和改善肝组织学形态，并可明显降低大鼠血清中ALT、AST、MDA和ROS产物，提高SOD活性和GSH含量，具有良好的抗炎和肝损伤保护作用[11-12]。连翘酯苷可通过减轻肉鸡氧化应激，抑制肝组织脂质过氧化反应，有效提高其肝脏抗损伤能力[13]。因此，小叶丁香枝叶富含保肝护肝活性成分，可通过发酵、复配加工等开发功能型畜禽饲料或饲料添加剂，具有良好的市场应用前景。
目前，尚未见报道关于同时测定小叶丁香中保肝护肝活性成分的检测方法。本研究采用高效液相法同时测定了小叶丁香中4种护肝活性成分，可为小叶丁香枝叶的综合开发利用和质量控制奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植株小叶丁香，购自中国(亳州)中药材交易中心，经陕西科技大学食品与生物工程学院药学系生药学讲师杨文娟鉴定，所购植株为Syringami-crophyllaDiels。
1.1.2试剂4种标准品橄榄苦苷(含量98.50%，批号AF20051703)、紫丁香苷(含量99.47%，批号AF9093171)、连翘酯苷B(含量98.53%，批号AF2052702)、松果菊苷(含量98.82%，批号AF20051710)，成都埃法生物科技有限公司产品;乙腈、甲醇，色谱纯，FisherScientific公司产品;其他试剂均为分析纯。
1.1.3仪器高效液相色谱仪(LC-16)，岛津中国公司产品;超纯水制备系统(MilliporeMillivPlus)，美国Millipore公司产品;电子天平(LE204E/02)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品;电子天平(JA2603B)，上海天美天平仪器有限公司产品;超声波清洗器(YM-1005)，深圳市方奥微电子有限公司产品。
1.2方法
1.2.1色谱条件色谱柱AkzoNobelKromasiLC18(4.6mm×250mm，5μm);流动相为乙腈(A)和1mL/L醋酸水溶液(B)梯度洗脱，洗脱程序为0～15min，5%～15%B、15min～20min，15%～20%B、20min～30min，20%～25%B、30min～60min，25%～40%B;流速为1.0mL/min;柱温30℃;进样量10μL;检测器为紫外检测器，采用254nm和330nm双波长检测。
1.2.2溶液的制备
1.2.2.1储备液的制备分别称取4种标准品适量，甲醇溶解并定容，配制成单一标准品储备液，置-4℃保存。其中，紫丁香苷和连翘酯苷B储备液浓度为1000μg/mL，橄榄苦苷储备液浓度为800μg/mL，松果菊苷储备液浓度为80μg/mL。
1.2.2.2标准品溶液的制备用甲醇将上述储备液分别稀释成标准品梯度溶液，置-4℃保存。其中，松果菊苷标准品梯度溶液的浓度分别为5、10、20、40、80μg/mL;橄榄苦苷标准品梯度溶液的浓度分别为50、100、200、400、800μg/mL;紫丁香苷和连翘酯苷B标准品梯度溶液的浓度分别为50、100、250、500、1000μg/mL。
1.2.2.3供试品溶液的制备取小叶丁香的茎叶，80℃干燥，粉碎。准确称取7.50g至200mL三角瓶，以10倍量950mL/L乙醇超声提取30min，提取2次，合并滤液，蒸干，加适量甲醇溶解，离心，上清液移至100mL容量瓶，甲醇定容，即得供试品溶液。测定前，用0.22μm微孔滤膜过滤。
1.2.3线性考察将“1.2.2.2”中4种活性成分的标准品梯度溶液，在“1.2.1”中规定的色谱条件下进行分析，记录色谱峰峰面积。以进样浓度(μg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线的回归方程和相关系数。
1.2.4精密度试验按“1.2.2.3”中方法制备供试品溶液，将同一样品连续进样6次，每次10μL，测定色谱峰峰面积，分别计算4种活性成分对应峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察测定方法的精密度。
1.2.5稳定性试验取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24h，每次进样10μL，测定色谱峰峰面积，分别计算4种活性成分对应峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察测定方法的稳定性。
1.2.6重复性试验按“1.2.2.3”中方法制备6份供试品溶液，每次进样10μL，测定色谱峰峰面积，分别计算4种活性成分对应峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察测定方法的重复性。
1.2.7加样回收率试验精密移取已知含量的小叶丁香供试品溶液，分别加入4种不同活性成分的对照品溶液，配制成加样样品溶液，每种活性成分配制6份，进样量为10μL，测定色谱峰峰面积，分别计算4种活性成分对应的加样回收率和相对标准偏差(RSD)。
1.2.8小叶丁香样品测定将不同批号的小叶丁香样品6份，分别制备成供试品溶液，每个供试品溶液测定2次，每次进样10μL，计算不同批号小叶丁香样品中橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B的平均含量。
1.2.9数据处理试验数据使用SPSS软件(19.0版)进行统计处理，数据表示为平均值±标准差。
2结果
2.1线性关系以进样浓度(μg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以最小二乘法做线性回归，标准曲线的回归方程和线性关系见表1。松果菊苷在5μg/mL～80μg/mL、橄榄苦苷在50μg/mL～800μg/mL、紫丁香苷和连翘酯苷B在50μg/mL～1000μg/mL浓度范围内，相关系数r为0.9998～0.9999，说明4种活性成分的峰面积与质量浓度的线性关系良好。
相关期刊推荐：《动物医学进展》(月刊)原名为《国外兽医学—畜禽疾病》，1980年创刊，主要报道国内外动物医学方面先进的理论与技术，基础与临床兼顾，读者对象为全国农业、医学院校师生，科研人员，畜牧兽医人员，包括动物检疫、兽医卫生防疫、动物卫生监督、动物疫病预防控制、畜禽产品检验与监督、兽药监督管理人员，畜禽疾病、宠物疾病、水生动物疾病、野生动物疾病防治人员，实验动物、比较医学等方面的科研人员，以及畜牧兽医行政管理人员。
4种活性成分标准品和供试样品测定的HPLC色谱图见图1，其主峰分离度均较好。
2.2精密度试验4种活性成分分别连续进样6次，理论塔板数均大于2500，保留时间和峰面积RSD见表2。橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B在色谱系统中保留时间均较稳定，RSD介于0.12%～0.22%，且所测得峰面积的RSD分别为2.01%、2.36%、2.09%和2.77%，表明该方法的仪器精密度良好。
2.3稳定性试验
4种活性成分供试品溶液制备后在室温放置24h，分别在规定时间测定主峰峰面积，其相对标准偏差RSD见表3。在24h内，橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B在色谱系统中保留时间均较稳定，RSD介于0.07%～0.15%，且所测得的峰面积也都未发生明显变化，相对标准偏差依次为1.67%、2.20%、1.88%和1.97%，表明该方法稳定性良好。
2.4重复性试验
4种活性成分对应峰面积的相对标准偏差(RSD)见表4。橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B在色谱系统中保留时间较稳定，RSD介于0.11%～0.95%，且所测得峰面积RSD分别为2.21%、2.37%、2.51%和2.92%，表明该方法重复性良好。
2.5加样回收率试验
4种活性成分对应的平均加样回收率和相对标准偏差RSD见表5。4种活性成分的加样回收率都介于95%～105%，符合药典要求。橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B的平均加样回收率分别为99.08%、95.20%、99.40%和98.69%，RSD值分别为1.73%、2.55%、2.83%和1.89%，表明该方法准确度良好。
2.6小叶丁香样品测定
经测定，不同批号小叶丁香样品中橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B的含量分别为0.709%±0.016%、0.452%±0.012%、0.059%±0.003%和0.512%±0.012%。
3讨论
本研究选用紫外检测器，其线性范围广，受影响的范围较小，可满足多组分同时测定的要求。根据《中华人民共和国药典第一部(2020年版)》规定[14]，紫丁香苷检测波长为265nm，松果菊苷检测波长为330nm。另有资料显示[15-16]，橄榄苦苷检测波长为285nm，连翘酯苷B检测波长为332nm。为兼顾方法的灵敏性和可操作性，本方法采用双波长检测，橄榄苦苷和紫丁香苷的检测波长确定为254nm，松果菊苷和连翘酯苷B的检测波长确定为330nm。
试验分别考察了甲醇-水、甲醇-1mL/L醋酸水溶液、甲醇-1mg/mL磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-1mL/L醋酸水溶液、乙腈-1mg/mL磷酸水等洗脱体系。结果发现，含甲醇流动相体系的分离度均不能全部满足要求，含乙腈流动相体系的分离度可以满足要求，且峰型较好。经优化，采用乙腈(A)-1mg/L醋酸水溶液(B)流动相体系梯度洗脱进行检测，梯度洗脱程序确定为0～15min，5%～15%B、15min～20min，15%～20%B、20min～30min，20%～25%B、30min～60min，25%～40%B。
试验比较了甲醇、乙醇和乙腈等溶剂对4种活性成分的提取率，并对超声、索氏、回流和渗漏等不同提取方法及其提取条件进行考察。结果表明，以10倍量950mL/L乙醇超声提取30min，提取2次的效果最好，提取率大于其他方法，且样品处理时间短、操作简单。
中国药典第一部(2020年)在暴马子皮和肉苁蓉2种药材或饮片的含量测定中规定了紫丁香苷和松果菊苷的检测方法，有关学者也分别研究了小叶丁香中橄榄苦苷和抗宫炎软胶囊中连翘酯苷B的HPLC测定方法。但是，这4种活性成分测定时，其供试品溶液制备方法，HPLC测定的流动相组成、洗脱程序及检测波长均不一致，无法直接参照用于同时测定小叶丁香中多组分的含量。本研究通过优化样品处理方法和HPLC色谱条件，建立了同时测定小叶丁香中4种护肝活性成分含量的方法，为评价小叶丁香的产品质量和护肝功效提供了理论依据。试验对采自不同地区的6份小叶丁香样品进行了检测，其茎叶富含护肝活性成分，橄榄苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和连翘酯苷B的平均含量分别为0.709%、0.452%、0.059%和0.512%。这表明小叶丁香可开发成具有养肝护肝功效的饲料或饲料添加剂，用于畜禽规模养殖。——论文作者：施春阳1，2，马养民3，刘玉枝1，梁承远1，李道明1
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