发布时间：2021-10-11所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 摘要背景：常用光敏剂疏水性强、缺乏靶向性等问题严重限制了光动力疗法的治疗效果。虽然纳米药物载体可将光敏剂靶向递送到肿瘤部位，但肿瘤部位的缺氧微环境严重削弱了光动力疗法的疗效。此外，光动力疗法可通过诱导肿瘤细胞免疫原性死亡激活宿主免疫应答，
摘要背景：常用光敏剂疏水性强、缺乏靶向性等问题严重限制了光动力疗法的治疗效果。虽然纳米药物载体可将光敏剂靶向递送到肿瘤部位，但肿瘤部位的缺氧微环境严重削弱了光动力疗法的疗效。此外，光动力疗法可通过诱导肿瘤细胞免疫原性死亡激活宿主免疫应答，但这也受到免疫抑制微环境的限制。目的：合成目标材料并评估其组装成复合纳米粒子后的各项性能、增强光动力疗法效果及联合免疫治疗的可行性。方法：通过氨基酸闭环反应、开环聚合、缩合反应等合成两亲性功能化聚赖氨酸和吲哚胺-2，3-双加氧酶小分子抑制剂NLG8189二聚体，通过透析法将其制备为纳米粒子的内核;加载全氟己烷并包裹透明质酸后得到HPe6DF纳米粒子，测试该复合纳米粒子的粒径、电位、表面形貌、酶响应性、氧气负载量、活性氧产生等能力。体外将HPe6DF纳米粒子与鼠源乳腺癌细胞4T1共培养，评估纳米粒子的细胞摄取、活性氧的产生、细胞毒性、细胞凋亡、免疫原性细胞死亡以及对吲哚胺-2，3-双加氧酶的抑制等能力。结果与结论：①实验成功制备了大小均一的球形HPe6DF纳米粒子，其粒径约150nm，电位约-20mV，该复合纳米粒子具有一定的透明质酸酶响应性、优异的氧气负载能力及活性氧产生能力;②与细胞复合培养实验结果显示，HPe6DF纳米粒子以时间依赖的方式在胞内累积，并且在其余条件相同时，透明质酸预孵育组的荧光强度明显弱于无透明质酸预孵育组，证明HPe6DF纳米粒子可通过跨膜糖蛋白CD44介导的方式加速入胞;在光照条件下，HPe6DF纳米粒子可有效提高胞内活性氧水平，从而促进细胞凋亡，进而诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，并且可以有效抑制肿瘤细胞内吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性;③结果表明，HPe6DF纳米粒子既可提高光动力效率、增强肿瘤细胞的免疫原性，还可以缓解肿瘤部位免疫抑制微环境。
关键词：纳米粒子;光动力疗法;缓解缺氧;免疫疗法;吲哚胺-2，3-双加氧酶;二氢卟吩e6;活性氧;细胞凋亡;免疫原性死亡
0引言Introduction
光动力治疗因其非侵入性、局部靶向、与其他治疗方法兼容性强等优点成为了目前肿瘤治疗研究的热点[1-3]。通常在特定的激光照射下，光动力疗法中的光敏剂可以吸收激光的能量，发生一系列化学反应后产生细胞毒性活性氧，导致肿瘤细胞凋亡和坏死，进而抑制肿瘤的生长[4-5]。然而，由于光动力疗法对氧气的依赖性，肿瘤缺氧的微环境使得光动力疗效严重受限，在实体瘤中这一现象更为明显[6-8]。同时，光动力疗法也通过产生活性氧消耗氧气，从而加剧肿瘤缺氧，导致光动力疗法无法充分发挥治疗效果。
迄今为止，研究人员已经开发出了多种缓解肿瘤缺氧的策略，例如在临床试验中已使用高压氧吸入来改善氧气水平，然而气压伤和高氧损伤等不良反应妨碍了其在临床上进一步的应用。此外，也有研究者利用过氧化氢酶和二氧化锰等催化肿瘤内过氧化氢分解原位产生氧气，但这种方法受到肿瘤细胞内过氧化氢浓度的限制[9-10]。全氟化碳因其化学和生物惰性、可靠的生物安全性及对氧气的高溶解度被选为运输氧气的载体，为改善肿瘤缺氧微环境提供了一种新策略[11-13]。
光动力疗法除了可以通过诱导凋亡或坏死杀死肿瘤细胞外，还会引起急性炎症激活抗肿瘤免疫反应[14-15]。已有研究证实，光动力疗法在治疗中会引起肿瘤免疫原性细胞死亡，并释放出相关抗原，促进树突状细胞成熟与抗原递呈，进而导致效应T细胞的增殖和激活。然而，在肿瘤微环境中的免疫逃避机制会通过调节相关因子的表达，如上调吲哚胺-2，3-双加氧酶的表达，进而严重损害光动力诱导的免疫反应[16-18]。目前，已有多种免疫检查点抑制剂，如程序性死亡受体1抑制剂等已被用于增强光动力疗法介导的免疫反应，以实现高效的联合抗肿瘤效果[19-21]。
此外，吲哚胺-2，3-双加氧酶作为一种免疫检查点在多种类型的实体瘤中高表达，且它可被一些小分子药物针对性抑制。吲哚胺-2，3-双加氧酶可催化色氨酸代谢为犬尿氨酸，从而抑制效应T细胞的分化和增殖功能，帮助形成免疫抑制微环境[22-24]。抑制吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性有利于缓解肿瘤部位免疫抑制微环境。
综上，缓解肿瘤细胞内缺氧可提高光动力疗效，同时结合吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂抑制肿瘤免疫抑制微环境，可增强光动力诱发的免疫应答能力，从而进一步增强肿瘤治疗效果。基于此，实验设计了以光敏剂二氢卟吩e6修饰的两亲性功能化聚赖氨酸为载体材料，负载NLG8189的二聚体药物和全氟己烷作为内核，静电复合透明质酸为外壳的HPe6DF纳米粒子，从而增强光动力疗法诱导的免疫治疗疗效[21，25-26]。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计材料制备和表征以及细胞学实验，两组间比较进行T-test分析，多组间比较进行单因素完全随机方差分析。
1.2时间及地点于2019年10月至2021年4月在四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心实验室完成。
1.3材料
1.3.1主要细胞与试剂鼠源乳腺癌细胞4T1购自中科院上海细胞研究所;二氢卟吩-e6、胱胺二盐酸盐、N-苄氧羰基-L-赖氨酸、二环己基碳二亚胺、羟基丁二酰亚胺(天津希恩斯生化科技有限公司);透明质酸(Mw=40000，华熙生物科技有限公司);小分子吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂NLG8189(美国Selleck公司);全氟己烷(九鼎化学科技有限公司);氢溴酸(Adamas-beta);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，上海安吉耐化学)、绿色单线态氧探针(大连美伦生物技术有限公司);活性氧检测试剂盒、三磷酸腺苷检测试剂盒和AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);RMPI1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司);胰蛋白消化酶(0.25%)和青霉素-链霉素(美国Gibco公司);γ-干扰素(近岸蛋白质科技有限公司);AlexaFluor488-钙网蛋白、AlexaFluor488-高迁移率蛋白1抗体(北京博奥森生物技术有限公司);乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、二甲亚砜等(成都科龙化工试剂)。
1.3.2主要设备与仪器1H核磁共振波谱仪(美国Bruker，AV-400);质谱仪(日本岛津，LCMS-IT-TOF);动态光散射仪(英国Malvern，ZetasizerNanoZS);紫外分光光度计(美国PerkinElmer，L650);透射电子显微镜(日本JEOL，JEM2100);便携式溶氧仪(上海仪电);酶标仪(美国Biorad，Model-550);高效液相色谱(HPLC，美国Aligent);激光共聚焦显微镜(德国Leica，TCPSP5);流式细胞仪FCM(美国BD，AccuriC6)。
1.4实验方法
1.4.1两亲性功能化聚赖氨酸的合成首先，将N-苄氧羰基-L-赖氨酸和三光气按摩尔比1∶1.3加入到重蒸后四氢呋喃溶剂中，50℃油浴下反应至溶液变澄清。将上述溶液旋浓后，使用大量无水正己烷反复沉淀清洗后得到赖氨酸内羧酸酐。然后，将脱盐酸后的胱胺和赖氨酸内羧酸酐按1∶20的摩尔比投入无水二氯甲烷中，反应48h后将溶液浓缩，加入大量乙醚沉淀。将过滤后得到的沉淀溶于三氟乙酸，并加入溴化氢的醋酸溶液反应3h，用乙醚沉淀后，将沉淀溶于水中透析4d后冻干得到聚赖氨酸。接着，将二氢卟吩e6、二环己基碳二亚胺和羟基丁二酰亚胺按摩尔比1∶1.21∶10投入10mL二甲亚砜中活化2h后，按聚赖氨酸和二氢卟吩e6摩尔比为1∶1.1的比例加入聚赖氨酸，反应48h后，用二甲亚砜透析除去未反应的二氢卟吩e6，再用水透析后冻干得到两亲性功能化聚赖氨酸。
合成材料采用1H核磁共振波谱仪进行了结构表征，结果显示：聚赖氨酸主链上的质子(δ=4.33ppm);胱胺上的两种亚甲基上的质子(δ=2.78，3.87ppm);聚赖氨酸侧链上的4个亚甲基上的质子(δ=2.78，1.60，1.36，1.25ppm)以及δ=7.4-8.5ppm处代表二氢卟吩e6的质子峰均在核磁氢谱中出现，证明成功合成了两亲性功能化聚赖氨酸。
1.4.2NLG8189小分子二聚体的合成用上述合成赖氨酸内羧酸酐的方法合成NLG8189内羧酸酐后，将胱胺和NLG8189内羧酸酐按摩尔比1∶2加入到无水二氯甲烷中反应48h，用乙醚沉淀并过滤后得到最终产物NLG8189小分子二聚体。用核磁和质谱分别进行了表征，核磁氢谱结果显示：苯环上4个氢(δ=7.00，7.12，7.35，7.55ppm)、与氮相连的甲基(δ=3.72ppm)、NLG8189亚甲基上2个氢δ=3.05，3.60ppm)、与氨基相连的碳上的质子(δ=4.18ppm)及胱胺上两种亚甲基质子(δ=3.65，2.67ppm)均出现在核磁氢谱中，证明成功合成了NLG8189小分子二聚体。高分辨率质谱中NLG8189小分子二聚体显示的分子量为552.76g/mol，与理论分子量相同，表明NLG8189小分子二聚体的结构与预期相同。
1.4.3纳米粒子的制备将500μL含有5mg两亲性功能化聚赖氨酸和1mg的NLG8189小分子二聚体的二甲亚砜溶液缓慢滴加到9mL水中，搅拌过夜，透析除去二甲亚砜后得到Pe6D纳米粒子。在超声下将5μL全氟己烷滴加到1mLPe6D纳米粒子中，5000r/min离心后得到Pe6DF纳米粒子。然后将Pe6DF纳米粒子和10g/L的透明质酸按体积比5∶1混合，涡旋1min后得到HPe6DF纳米粒子。将透析的Pe6D纳米粒子和10g/L的透明质酸按体积比5∶1混合，涡旋1min后得到HPe6D纳米粒子。
1.4.4纳米粒子的理化性能表征
粒径和电位：Pe6D、Pe6DF、HPe6DF纳米粒子的粒径和电位通过动态光散射来表征。通过检测HPe6DF纳米粒子在透明质酸酶孵育下的粒径和电位随时间变化，评估其酶响应特性;通过检测HPe6DF纳米粒子在体积分数10%血清溶液和5%葡萄糖溶液中的粒径和电位随时间变化，评估其稳定性。
载药量：用紫外分光光度计测定二氢卟吩e6含量，配制不同浓度的二氢卟吩e6溶液做标准曲线，测量其在660nm处的吸光度值，并绘制浓度-吸光度值曲线，计算样品中的二氢卟吩e6含量。使用高效液相色谱测定NLG8189的载药量，配制不同浓度的NLG8189溶液做标准曲线，高效液相色谱测定，以峰面积对浓度进行线性回归，做标准曲线并计算样品中NLG8189含量。其中色谱柱为C18柱(EclipseXDB-C184.6mm×150mm，5μm，Aligent)，流动相为乙腈∶水=10∶90(均含0.1%三氟乙酸)，流速为0.5mL/min。载药量=A/(A+B)×100%，其中A为纳米粒子中药物质量，B为纳米粒子中载体材料质量。
形貌表征：使用透射电子显微镜观察Pe6DF、HPe6DF纳米颗粒的形貌。
氧气负载能力：将2mL的HPe6D、HPe6DF纳米粒子分别装在10mL离心管中，用氧气瓶向溶液中鼓氧，每秒一个气泡的频率鼓氧1min后，使用便携式溶氧仪检测其在15min内的溶解氧含量。
活性氧产生能力：使用激光(660nm，0.5W/cm2)照射含有50μmol/L绿色单线态氧探针的HPe6D、HPe6DF纳米粒子溶液，然后测量其在504nm激发下514-580nm的发射曲线。
1.4.5细胞实验
细胞培养：将鼠源乳腺癌细胞4T1以5×105/皿的浓度接种于直径10cm的培养皿，并添加含有体积分数10%血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的RPMI1640培养基，在体积分数5%二氧化碳环境下于37℃细胞培养箱中进行培养，当细胞生长至70%-80%时进行传代，每2d传代一次。
细胞摄取：将4T1细胞以5×104/皿的密度接种在玻底皿中，待细胞贴壁后，加入含HPe6DF纳米粒子(二氢卟吩e6的质量浓度为4mg/L)和透明质酸+HPe6DF纳米粒子(提前加入质量浓度10g/L的透明质酸预孵育2h)的培养基分别继续培养细胞1，2，4h。孵育结束后，用Hoechst33342(10mg/L)染色15min，通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒子入胞情况。对于细胞摄取效率的定量分析，在纳米粒子与细胞孵育1，2，4h后，消化并收集细胞，制成单细胞悬液后用流式细胞仪FCM定量检测二氢卟吩e6的荧光强度。
胞内活性氧产生：将4T1细胞以5×104/皿的密度接种在玻底皿中，待细胞贴壁后，分别加入HPe6D和HPe6DF纳米粒子(二氢卟吩e6的质量浓度为2mg/L)孵育4h。孵育完成后先移除培养基，再加入500μL浓度为10μmol/L的活性氧检测探针DCFH-DA孵育30min。使用660nm的激光灯(1W/cm2)照射1min后加入Hoechst33342溶液染核，最后用激光共聚焦显微镜获取荧光图像。对于流式定量分析，在光照后直接消化收集细胞上机检测。对照组为单纯培养的4T1细胞，不进行光照处理，在与活性氧检测探针DCFH-DA探针孵育后直接进行分析。
细胞毒性：将4T1细胞按5×103/孔的密度接种到96孔板中孵育24h，再将HPe6D、HPe6DF和HA+HPe6DF纳米粒子按二氢卟吩e6浓度为0.5，1，2，4，6mg/L分别加入孔板中。孵育4h后移除上清液，并更换新鲜培养基，用660nm的激光灯(1W/cm2)照射1min，再孵育20h后，吸出培养基加入0.5g/LMTT溶液孵育4h，加入二甲亚砜震荡3min，用酶标仪检测490nm处吸光度值，计算细胞存活率。
细胞凋亡：将4T1细胞按1×105/孔的密度接种到6孔板中，孵育24h后，分别加入二氢卟吩e6质量浓度为4mg/L的HPe6D和HPe6DF纳米粒子。孵育4h后更换新鲜培养基，再用660nm的激光灯(1W/cm2)照射1min，再孵育4h。最后消化收集细胞，经细胞凋亡检测试剂盒染色后，用流式细胞仪检测。
免疫原性细胞死亡相关因子检测：将4T1细胞按5×104个/皿的密度接种到玻底皿中，孵育24h后，分别加入二氢卟吩e6质量浓度为2mg/L的HPe6D和HPe6DF纳米粒子。对照组为单纯培养的4T1细胞，不进行光照处理。孵育4h后，移除上清液更换新鲜培养基，用660nm的激光灯(1W/cm2)照射1min，再孵育4h后，分别加入稀释300倍的AlexaFluor488-钙网蛋白和AlexaFluor488-高迁移率蛋白1抗体(500μL)孵育1h，最后用激光共聚焦显微镜观察。对于三磷酸腺苷的检测，在光照完孵育4h后取上清液离心，采用三磷酸腺苷检测试剂盒检测上清液中三磷酸腺苷的浓度。
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胞内吲哚胺-2，3-双加氧酶活性的抑制检测：将4T1细胞按5×103孔的密度接种到96孔板中，并加入终质量浓度为50µg/L的γ-干扰素孵育24h，然后分别加入NLG8189和HPe6DF纳米粒子孵育48h。对照组为单纯培养的4T1细胞，不进行任何处理。最后每孔取150μL上清液到新的96孔板中，再分别加入75μL30%三氯乙酸沉淀蛋白质，50℃孵育30min后，5000r/min离心8min，取150μL上清液加入75μL含有2%对二甲氨基苯甲醛的冰醋酸溶液，测定其在490nm处的吸光度值。
1.5主要观察指标HPe6DF纳米粒子的理化性能及体外抗肿瘤效果。
1.6统计学分析实验数据的统计结果均以x-±s表示，两组之比较进行T-test分析，多组间比较进行单因素完全随机方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有显著性意义。
2结果Results
2.1HPe6DF纳米粒子的理化性能采用透析法制备纳米粒子内核Pe6D，Pe6D加载全氟化碳并包裹透明质酸后得到HPe6DF纳米粒子，并使用动态光散射仪和透射电镜等对其粒径、电位和形貌等进行表征。
图1A、B是不同纳米粒子的粒径、电位测试结果，Pe6DF纳米粒子的粒径约为90nm，电位约为+45mV;HPe6DF纳米粒子的粒径增大到150nm，电位降低到-20mV。图1C、D的透射电镜图像展示了包裹透明质酸前后纳米粒子的形貌，包裹透明质酸前的Pe6DF纳米粒子呈大小均一的球形，包裹透明质酸后的HPe6DF纳米粒子粒径增大并具有核壳结构。
图2A、B为HPe6DF纳米粒子与透明质酸酶(100-250U/mL)共同孵育不同时间的粒径和电位变化图，从图中可以看出，随着时间的增加，HPe6DF纳米粒子的粒径和电位均逐渐增加，表明其具有一定的透明质酸酶响应性。图2C是HPe6DF纳米粒子孵育在体积分数10%血清和5%葡萄糖溶液中粒径随时间的变化曲线，从图中可以看出，随着培养时间的延长，HPe6DF纳米粒子在体积分数10%血清和5%葡萄糖溶液中孵育时粒径几乎未发生变化，电位测试结果也保持正常波动。图2D是不同样品中的溶解氧含量随时间变化，从图中可以看出，在加载氧气前各组氧气浓度基本相同，在加载氧气后各组氧气浓度均明显上升，且HPe6DF组氧气浓度最高。由紫外和高效液相色谱分别检测了二氢卟吩e6和NLG8189的载药量，二者的载药量分别为11.84%和5.41%。
图3是HPe6D和HPe6DF纳米粒子在溶液中产生活性氧能力评估实验的结果，由图中可以看出，在光照相同时间的条件下，与HPe6D组相比，HPe6DF组荧光强度增加更为明显，表明其活性氧产量更高。
2.2肿瘤细胞对HPe6DF纳米粒子的摄取图4，5分别是细胞对HPe6DF纳米粒子摄取的激光共聚焦图像和流式检测结果，可以看出随孵育时间的增长，细胞中代表二氢卟吩e6的红色荧光逐渐增强;并且在纳米粒子浓度和孵育时间相同的条件下，透明质酸预孵育组红色荧光较弱;流式定量结果中荧光强度变化与激光共聚焦结果一致。
2.3肿瘤细胞胞内活性氧产生图6A、B分别为不同处理条件下细胞内的活性氧产生情况的激光共聚焦显微镜图片和流式结果图，与对照组相比，光照后的HPe6D组和HPe6DF组均出现了明显绿色荧光，且HPe6DF组荧光最强。流式定量结果与激光共聚焦显微镜图像结果一致。
2.4HPe6DF纳米粒子的细胞毒性和对细胞凋亡的影响图7A、B显示了不同纳米粒子处理下在有无光照时的细胞存活率，在不光照条件下，各组均无明显毒性;光照后，细胞毒性以剂量依赖的方式增加，其中HPe6DF处理组细胞存活率最低，表明其最低毒性最大，且透明质酸预孵育处理组细胞存活率明显更高。图7C展示了细胞经过不同处理后的凋亡情况，无光照的条件下，HPe6D组凋亡比例与生理盐水组几乎相同;光照后，HPe6D组和HPe6DF组的晚期凋亡比例分别达到22.2%和37.8%。——论文作者：蔡胜胜，梅衡，张学全，邓劲，曹俊，何斌
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