发布时间：2019-10-25所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要：苦马豆素(swainsonine, SW)是有毒的吲哚里西啶类次生代谢产物，它可抑制-甘露糖苷酶活性，使动物中毒，还具有抗肿瘤和免疫调节作用，成为关注热点。文章综述了豆类丝核菌、金龟子绿僵菌、疯草内生真菌和稻瘟病菌四类真菌中苦马豆素的生物合成途径及所
摘要：苦马豆素(swainsonine, SW)是有毒的吲哚里西啶类次生代谢产物，它可抑制α-甘露糖苷酶活性，使动物中毒，还具有抗肿瘤和免疫调节作用，成为关注热点。文章综述了豆类丝核菌、金龟子绿僵菌、疯草内生真菌和稻瘟病菌四类真菌中苦马豆素的生物合成途径及所涉及的调控酶的研究进展，旨在为揭示真菌合成苦马豆素途径中的未知细节提供参考，对于疯草的综合治理及苦马豆素的应用有积极意义。
关键词：苦马豆素;生物合成;真菌
国际上将含苦马豆素(swainsonine, SW)的豆科棘豆属(Oxytropis glabra DC.)和黄芪属(Astragalus) 植物统称为疯草，疯草是目前危害草原畜牧业最严重的毒草类型[1-2]。牲畜采食疯草到一定剂量后会引发病变，兽医毒理学家称之为疯草病。SW (C8H15NO3)是引起动物疯草病的唯一毒素[3]，其阳离子半椅式构象类似于甘露糖阳离子，能与甘露糖苷竞争性结合，抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性，使牲畜细胞空泡变性，失去正常功能，中毒严重者死亡[4-7]。在医学领域，苦马豆素被作为研究糖蛋白N-寡糖合成的工具药，20世纪80年代发现苦马豆素具有抗肿瘤和免疫调节作用，被广泛关注[8-13]。2006年我国学者完成了苦马豆素抗癌新型医药制剂“棘豆扶正胶囊”[兰制字(2006)F68104]的药学、药理和抗辐射研究，现已应用于癌症的治疗[14]。
目前已知生物有棘豆属(Oxytropis)、黄芪属 (Astragalus)、牵牛属(Pharbitis)、里韦亚属(Turbina) 的一些物种及锦葵科的Sida carpinifolia均检测到苦马豆素。Braun等[15]从美国3种植物(Oxytropis lambertii、Oxytropis sericea和Astragalus mollisimus)分离培养出产苦马豆素的Alternaria内生真菌;卢萍[5] 从内蒙古小花棘豆(Oxytropis glabra)中分离培养出产苦马豆素的Embellisia内生真菌(后变更为Alter-naria)。国际上将棘豆属、黄芪属等有毒植物统称为疯草，故将这类合成苦马豆素的内生真菌称为疯草内生真菌[16]。除此之外，豆类丝核菌(Rhizoctonia legumimicola)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和稻瘟病菌(Magnaporthe)也可合成苦马豆素。本文主要对R.legumimicola、M.anisopliae、 A.oxytropis和Magnaporthe中苦马豆素的生物合成途径研究进展进行综述。
1 豆类丝核菌中的苦马豆素合成代谢
豆类丝核菌(Rhizoctonia legumimicola)是担子菌类(Basidiomycete)无孢菌群(Myceliasterilia)丝核菌属(Rhizoctonia)病原真菌[17-18]，广泛寄生于大豆、苜蓿、红三叶等牧草中，动物采食侵染植物引发中毒[19-20]。起初认为毒性化合物是根霉菌胺 (又称流涎胺)，它是赖氨酸和哌啶酸的代谢产物，后通过标记哌啶酸的[R-3H]发现，除根霉菌胺外，哌啶酸的代谢产物还有另一种弱碱性生物碱。Broquist等[21]通过分离鉴定该生物碱确定为苦马豆素，根霉菌胺及苦马豆素两种生物碱都属于吲哚里西啶类。
Harris等[22-24]推测，在产苦马豆素的豆类丝核菌中由赖氨酸到哌啶酸合成的途径为：L-赖氨酸 →酵母氨酸→α-氨基己二酸半醛→6-羧基-哌啶酸 (△1-piperidine-6-carboxylate，P6C)→哌啶酸(别称：六氢吡啶羧酸或哌可酸)，Wickwire等[25]提出哌啶酸的直接前体为P6C，推测苦马豆素可能的合成途径是：L-赖氨酸在哌啶酸脱氢酶作用下生成酵母氨酸，酵母氨酸经酵母氨酸还原酶催化生成α- 氨基己二酸半醛(酵母氨酸还原酶热稳定性差，46 ℃ 失活，能催化双向反应，pH为中性时向正反应方向还原生成酵母氨酸;pH为碱性时向逆反应方向脱氢生成谷氨酸[21])，α-氨基己二酸半醛经构型改变生成P6C，又在6-羧基-哌啶酸还原酶催化下生成哌啶酸，哌啶酸和丙二酸反应生成乙酸哌啶，还原环化后生成1-酮基-吲哚里西啶，1-酮基-吲哚里西啶在还原酶作用下生成(1R，8aS)-羟基吲哚里西啶和(1S，8aS)-羟基吲哚里西啶，经两次羟化反应，(1R，8aS)-羟基吲哚里西啶形成苦马豆素，而 (1S，8aS)-羟基吲哚里西啶形成根霉菌胺。豆类丝核菌中根霉菌胺和苦马豆素合成途径如图1所示。
2 金龟子绿僵菌中的苦马豆素合成代谢
Sorokin建立绿僵菌属，但由于不同学者采用标准有区别，其分类较混乱。目前国际上普遍接受的分类观点由Tulloch[26]提出，绿僵菌属有2个种，即金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)包括小孢变种和大孢变种，均可合成苦马豆素[27]。
Sim等[18]推测苦马豆素以L-赖氨酸为前体，在酵母氨酸还原酶作用下生成酵母氨酸，酵母氨酸在酵母氨酸氧化酶作用下氧化生成哌啶酸或α-酮戊二酸，α-酮戊二酸经一系列反应生成α-氨基已二酸半醛，再通过非酶促环化反应形成哌啶酸，由哌啶酸转化为苦马豆素[29]。在豆类丝核菌中生成苦马豆素的直接前体物是1-酮基-吲哚里西啶，反应过程中有两个分支，最终形成两种产物;而在金龟子绿僵菌中无分支，但生成哌啶酸有两条途径。绿僵菌中苦马豆素合成途径如图2。
3 疯草内生真菌中苦马豆素合成代谢
Braun等[15]从美国三种疯草(Oxytropis lambertii、Oxytropis sericea和Astragalus mollisimus)分离培养出产苦马豆素内生真菌。卢萍等[5]在小花棘豆 O. glabra中分离出内生真菌，体外培养后合成了苦马豆素，未检测到该内生真菌的宿主植物都不含苦马豆素，因此提出苦马豆素由该内生真菌产生，当时鉴定为Embellisia，Pryor等[30]将Embellisia oxytropis修订为Undifilum oxytropis，之后Woudenberg等[18]又修订为Alternaria oxytropis，亦称疯草内生真菌。本课题组培养出的小花棘豆内生真菌Alternaria oxytropis形成白色绒毛状、边缘整齐的菌落，中间有隆起，分泌黑色素，菌落颜色最初是白色，逐渐变为灰色，最终为黑色。
酵母氨酸还原酶是内生真菌生物合成苦马豆素的关键酶之一，Mukherjee等[31]在美国疯草内生真菌中敲除该基因，发现敲除突变株里苦马豆素及其前体物哌啶酸的含量增加，而酵母氨酸和赖氨酸含量降低，推测酵母氨酸还原酶基因失活导致真菌突变株里哌啶酸及其前体的积累，使苦马豆素含量增加，酵母氨酸还原酶的活性影响了苦马豆素合成。
卢萍课题组克隆到小花棘豆内生真菌Embellisia (修订为Alternaria)酵母氨酸还原酶cDNA全长序列 (KJ944635)和基因序列(KY052048)，与Braun等[15] 的美国疯草内生真菌的酵母氨酸还原酶基因序列进行比对分析，一致度为82.3%，构建了基因缺失载体，转化至原生质体再生和筛选，得酵母氨酸还原酶基因敲除突变株[13]。利用不同培养基[32]或在培养基添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸和哌啶酸[33]，比较不同培养时间野生株和突变株中苦马豆素合成动态变化，发现野生株的苦马豆素含量高于突变株，但赖氨酸含量变化不大，酵母氨酸还原酶基因的确影响真菌的苦马豆素合成，但影响的结果与Mukherjee等[31]的结果有区别，其中哌啶酸作用最大。突变株中苦马豆素生成量低于野生株，而赖氨酸含量在两种菌株变化不大，推测是由于酵母氨酸还原酶基因缺失使酵母氨酸和赖氨酸合成受阻，鉴于赖氨酸是必需氨基酸，酵母氨酸是赖氨酸合成的前体，可能需要从逆反应方向在酵母氨酸氧化酶催化下，使P6C转变成酵母氨酸，再合成赖氨酸，使其含量保持在一定水平，以维持真菌的正常生命活动。同时苦马豆素也是由P6C转化而来，但其最为一种次生代谢产物并非机体所必需，故其含量在突变株中降低。
杨国栋等[16]用碳氮标记(C12，N15的α位)赖氨酸做示踪试验，发现标记的C12和N15转移到哌啶酸和苦马豆素。研究疯草内生真菌苦马豆素合成时，张蕾蕾等[34]在液体培养基添加L-赖氨酸、哌啶酸、α-酮戊二酸及聚乙二醇等化合物，均对内生真菌生长和菌丝苦马豆素产量影响显著;在固体培养基中添加赖氨酸、哌啶酸、α-氨基己二酸等化合物，研究苦马豆素动态合成，发现哌啶酸对苦马豆素合成影响最大，且在菌落的不同生长时期，苦马豆素合成量变化趋势呈抛物线，在29 d达到最高[33]。近期有研究推测苦马豆素生物合成途径可能有两条，即P6C途径和P2C途径[35-37]。在 P6C途径中，L-赖氨酸→酵母氨酸→α-氨基己二酸半醛的反应均在酵母氨酸脱氢(saccharopine dehydrogenase，SDH)催化下进行;α-氨基己二酸半醛在酵母氨酸氧化酶(saccharopine oxidase，FAP2)作用下生成P6C，逆反应在SDH作用下进行;P6C在吡咯啉-5-羧酸还原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)作用下生成哌啶酸，逆反应在哌啶酸氧化酶(L-pipecolate oxidase，PIPOX)作用下进行; 1-酮基-吲哚里西啶是酮类化合物，推测哌啶酸可能在聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)催化下变为1-酮基-吲哚里西啶，最后可能通过P450家族酶 (cytochrome P450)催化生成苦马豆素，PKS和P450 是调控次级代谢和非核糖体多肽合成的关键酶，种类众多，作用机理多样[38-39]，它们在苦马豆素合成途径中的作用机制还需深入探索。P2C途径是新近推测的另一条苦马豆素生物合成途径，由L-赖氨酸→α-己酮酸→P2C→哌啶酸→1-酮基-吲哚里西啶→苦马豆素，该途径涉及的酶尚不清楚，需深入研究。疯草内生真菌苦马豆素部分代谢如图3。
4 稻瘟病菌中苦马豆素的合成
子囊菌(Magnaporthe oryzae)，能引起水稻稻瘟病，这是一种突发性强、易于流行的水稻重要病害之一，对水稻危害极大[40]。目前关于Magnaporthe的报道多集中对水稻稻瘟病的研究，而关于其苦马豆素生物合成途径研究报道极少。Cook 等[41]通过使用靶向苦马豆素的基因簇比较基因组分析发现稻瘟病菌中一同源基因簇与苦马豆素的合成有关，命名为“SWN”。该基因簇包含swnK (PKS-NRPS multifunctional enzyme gene)、swnN (an NmrA-like，NADB Rossmann-fold reductase gene)、swnR(an NADB Rossmann-fold reductase gene)、swnH1(2-oxoglutaratedependent dioxidase gene)、swnH2(Fe(II)-dependat dioxidase gene)、 swnA(Amino transferase gene)和swnT(Transmembrane choline transporter gene)等结构域，后利用同源重组的方法敲除该基因簇，得到缺失突变体 ΔswnK。研究发现突变体不产苦马豆素，互补株恢复了苦马豆素生物合成，认为“SWN”与苦马豆素生物合成密切相关。
5 展望
目前，有关真菌苦马豆素生物合成途径大多由S.leguminicola和M.anisopliae的研究中得出，但近年来对其苦马豆素合成的研究停滞不前，仍有许多未解之谜。最初A.oxytropis中的苦马豆素生物合成途径是由S.leguminicola和M.anisopliae推测而来的，近年来虽通过基因组学研究取得了部分成果，可依旧有许多细节未知[37-42]。
未来可通过高通量测序技术对苦马豆素代谢途径进行探索，筛选与苦马豆素合成的相关基因，进行候选基因的敲除或过表达研究，获得突变体，进一步细化疯草内生真菌A.oxytropis的苦马豆素生物合成途径的各个步骤。另外，也可探索获得使宿主有生长发育和抗逆性优势、又不产苦马豆素的内生真菌，对疯草进行遗传改良，促进草地生态系统的良性循环;还可构建苦马豆素过表达真菌突变株，提取苦马豆素用于癌症治疗和免疫调节。
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