发布时间：2019-11-09所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 背景：人多能干细胞源神经细胞移植治疗帕金森病的研究已经取得极大进展，进入了亚临床研究阶段，但依然有许多问题亟待解决，其中一个问题是分化的异质性，这种异质性可以引起移植后宿主体内肿瘤形成、异动症的发生，给患者带来了潜在的、不可预估的安全风险
背景：人多能干细胞源神经细胞移植治疗帕金森病的研究已经取得极大进展，进入了亚临床研究阶段，但依然有许多问题亟待解决，其中一个问题是分化的异质性，这种异质性可以引起移植后宿主体内肿瘤形成、异动症的发生，给患者带来了潜在的、不可预估的安全风险。
目的：总结人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的现状、分化方案设计的原理、诱导流程和异质性分化的研究现状，为其移植治疗实现临床转化奠定理论基础。
方法：英文检索词为“iPSC AND Parkinson’s Disease，Induced pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease，ES cells AND Parkinson’s Disease，Embryonic stem cells AND Parkinson’s Disease，Pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease”，中文检索词为“多能干细胞 AND 帕金森病，诱导多能干细胞 AND 帕金森病，胚胎干细胞 AND 帕金森病”，由第一作者检索 1980 至 2018 年 PubMed 数据库、中文中国知网数据库和万方数据库，查阅近年诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的相关文献，最终保留 46 篇文献进行总结。
结果与结论：多能干细胞应用各种不同体外诱导分化方案，可诱导分化为 A9 多巴胺能神经元，移植后可以促进帕金森病模型动物的行为学及肢体功能的恢复。然而目前的分化方案产物中除了可以分化为 A9 多巴胺能神经元外，还包括 A10 多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元等不同的神经元，尚无一种分化方案可以达到均一性分化。优化多能干细胞体外诱导分化条件，同质性分化为 A9 多巴胺能神经元可以进一步改善帕金森病模型动物的行为学表现，促进该细胞疗法的临床转化。
关键词：帕金森病;诱导性多能干细胞;多巴胺能神经元;细胞分化;细胞移植;异质性;干细胞;国家自然科学基金
0 引言 Introduction
帕金森病是最常见的中枢神经系统退行性疾病，主要发病机制为纹状体区多巴胺递质降低，临床症状包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍等运动症状[1]，以及嗅觉减退、快动眼期睡眠行为异常、便秘和抑郁等非运动症状[2]。最明显的病理特征为黑质致密部A9多巴胺神经元选择性变性和细胞内Lewy小体聚集，但A9多巴胺神经元选择性变性的原因尚不清楚[3]。随着人口老龄化和寿命的延长，帕金森病的发病率不断增加，中国65岁以上人群患病率约1.7%，约260多万帕金森病患者，几乎占了全世界患者的一半，给家庭和社会带来沉重的负担[4]。
帕金森病的药物治疗已经有50多年的历史，药物以左旋多巴或多巴胺能受体激动剂的形式作用于功能失调的多巴胺能神经网络来减轻运动障碍。这些治疗在疾病早期非常有效，但最终会产生严重的不良反应，如运动并发症(症状波动、异动症)，幻觉和一系列中枢多巴胺受体的非生理刺激相关的行为和精神症状[5]。在疾病后期药物无法控制运动并发症的情况下，脑深部电刺激、皮下注射阿扑吗啡、卡比多巴-左旋多巴肠凝胶连续输注等辅助疗法可以作为备选治疗手段[6]。这些辅助疗法对控制运动并发症有一定疗效，但其局限性也不容忽视，如对非运动症状作用有限，相关不良事件、感染、脑血肿以及心理和行为异常等发生率较高[7-8]。综上所述，药物治疗和设备辅助治疗仅仅可以减轻疾病症状，不能治愈或减缓疾病进程。
鉴于其流行病学重要性，帕金森病可被视为一个公共卫生问题，其表现包括社会、家庭、经济、甚至法律问题，并对医疗保健系统造成巨大的经济影响[9]。因此，需要寻找新的疗法以治愈或延缓帕金森病的进展。最理想的疗法是替代已经失神经支配的多巴胺能神经元，重建生理性多巴胺输送系统。
胚胎腹侧中脑组织中含有多巴胺能神经祖细胞，由于诸多问题，移植该组织细胞进行细胞替代治疗帕金森病难以大规模开展。人多能干细胞因其拥有自我更新和分化成多种人类细胞类型的潜能，为帕金森病细胞治疗提供了可能，文章综述了细胞替代疗法发展与现状，介绍了中脑多巴胺能神经元发育的前后模式和背腹模式。人多能干细胞体外诱导分化方案模拟人胎脑正常中脑发育模式来设计，经过神经干细胞、中脑多巴胺能祖细胞、终末细胞成熟，其可分化为A9多巴胺能神经元，重建生理性多巴胺输送系统，移植后可以促进帕金森病模型动物的肢体功能恢复[10]。
在体内，细胞分化受到局部分泌的形态发生素和生长因子的调节，且分化过程需要各种形态发生素在时间和空间上精密调控，其可诱导细胞内途径的激活，通过激活特定的转录因子，促进相关基因表达进而导致细胞分化。由于目前尚未完全掌握相关分化的机制，在体外分化产生是多巴胺能神经元和其他非典型的细胞类型如丘脑底核的5-羟色胺神经元的混合物。多巴胺能神经元包括3个亚型：A8，A9和A10亚群，但宿主脑内只有产生A9多巴胺能神经元才能整合到去神经支配的纹状体，促进肢体运动功能恢复。这种异质性可以引起移植后宿主体内肿瘤形成、异动症的发生，给患者带来了潜在的、不可预估的安全风险。目前研究热点集中在如何优化多巴胺能神经祖细胞，对终末分化的异质性现象尚未引起足够重视。文章分析总结了异质性分化带来的后果及产生该现象可能机制，归纳了相关实验研究进展，提出了解决该问题的可能改善策略，为将来同质性分化以及移植效果的优化提供了参考。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 资料来源 英文检索词“iPSC AND Parkinson’s Disease ， Induced pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease ， ES cells AND Parkinson’s Disease ， Embryonic stem cells AND Parkinson’s Disease ， Pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease;中文检索词“多能干细胞 AND 帕金森病，诱导多能干细胞 AND 帕金森病，胚胎干细胞 AND 帕金森病”，由第一作者在2018年3月进行检索，检索1980 至2018年PubMed 数据库、中国知网数据库和万方数据库，查阅近年诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的相关文献，最终保留46篇文献。
1.2 入选标准 ①内容相关程度高;②具有原创性，且观点明确，论据可靠的文献;③内容相近的选择近期或在权威杂志发表的文献。
1.3 质量评估 共收集到581篇相关文献。阅读标题和摘要进行初筛，最后保留46篇相关度高，且符合核心内容的文章进行综述。文献筛选流程见图1。
2 结果 Results
2.1 帕金森病的细胞替代疗法现状 胚胎腹侧中脑组织中含有多巴胺能神经祖细胞，其移植治疗帕金森病患者的临床研究已经开展了30多年。尽管临床结局好坏不一，但这些临床研究已证明细胞替代疗法的确是一种非常有希望的治疗策略，成为持续的研究热点[10]。然而由于伦理问题，难以得到大量的胎儿中脑组织，存在移植物质量参差不齐，难以标准化等问题，胚胎腹侧中脑细胞移植很难大规模开展。
人多能干细胞(human pluripotent stem cells， hPSCs)包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)，均具有自我更新和分化成多种人类细胞类型(包括中脑多巴胺能神经元)的潜能[11]。因此，人多能干细胞为细胞替代疗法的开展提供了有价值的资源[12-13]。通常情况下，人多能干细胞在体内分化的不可控性，并不适合直接移植。此外，神经干细胞倾向于分化为中间神经元类型和星形胶质细胞，体外很难产生足够数量的多巴胺能神经元，因此从治疗的安全性和有效性综合考虑，移植已经定向的多巴胺能祖细胞更具可行性[14]。Kikuchi小组[15]的实验显示无饲养层和无血清条件下由人诱导多能干细胞分化衍生的多巴胺能神经元，在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP)损伤的帕金森病猴体内存活6个月。该报道支持人诱导多能干细胞对未来临床试验的治疗潜力。Kirkeby 小组[16]则使用优化的方案分化人胚胎干细胞，将衍生的多巴胺能神经元移植入纹状体内，能改善6-羟基多巴胺诱导的半帕金森病大鼠运动功能。同时多个研究小组证实，通过特定的诱导方案可将人多能干细胞分化为A9 多巴胺能神经元[17-19]。移植后的多巴胺能神经元可以在动物模型脑内存活、神经支配，促进功能修复[20-21]，而没有产生肿瘤[22]。2017年中国科学院周琪院士主持的 “人胚胎干细胞来源的神经祖细胞治疗帕金森病”的临床前期研究在郑州大学第一附属医院正式开展，表明干细胞替代疗法已经十分接近临床。
2.2 当前人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经元诱导方案的设计基本原理及机制
2.2.1 中脑多巴胺能神经元发育的前后模式和背腹模式 在胚胎发育过程中，发育模式和细胞命运特异性分化受到局部分泌的形态发生素和生长因子的调节。神经的形成是一个发展的过程。它从外胚层开始，神经上皮层或神经板折叠形成神经管，大脑和脊髓从该神经管发育而来。神经管沿着延喙尾轴和背腹轴生长，此发育模式在时间和空间上受沿前后模式和背腹模式轴分布的形态发生素浓度梯度的协调控制。此过程中，细胞分化由形态发生因子和邻近细胞分泌的信号分子诱导[23]。影响前后模式的形态发生素包括成纤维细胞生长因子、 WNT和视黄酸，经典WNT/ β-catenin信号通路在其中扮演了关键角色。影响背腹模式的成分包括WNT、骨形态发生蛋白和音猬因子，SHH信号通路起到了决定性作用。沿前后模式和背腹模式轴分布的形态发生素浓度梯度限定了转录密码和特定区域神经前体细胞的身份，见图2。形态发生素浓度轻微的变化就可以引起细胞命运的转变[24]。这两种模式是体外方案中调控WNT信号通路和SHH信号通路可以决定中脑神经前体表型的理论依据。
2.2.2 分化方案的步骤及设计原理 人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经元诱导方案模拟人胎脑正常中脑发育模式，几乎所有分化方案都围绕下述原理和机制来设计。
第一阶段为神经诱导，即外胚层细胞向神经干细胞的分化。该分化受到属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)蛋白超家族的骨形态发生蛋白的调控。因此，通过抑制骨形态发生蛋白和TGF-β/ SMAD信号传导可启动神经诱导[25]。在分化方案的起始阶段，采用“双SMAD抑制剂”策略保证神经方向分化。 SB431542和NOGGIN分别抑制 Lefty/Activin/TGFβ/ SMAD通路和BMP/SMAD信号通路，使干细胞退出多能干状态，分化为神经干细胞，以确保外胚层既不分化为表皮组织，又不分化为内、中胚层组织[24]。
第二阶段为中脑多巴胺能神经祖细胞的定型和区域化。神经干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞。中脑正常发育定型有两个信号中心，中脑腹侧底板(floor plate， FP)的Shh-Foxa2信号回路和中、后脑交界处峡部组织 (isthmic organizer，IsO)的OTX2-WNT1-Lmx1a/Msx1 信号回路。前者决定了神经祖细胞的腹侧身份，后者决定了其后端侧身份，这两个信号回路之间互相作用，产生了微妙的动态平衡，决定了中脑多巴胺能神经祖细胞正确的身份。在此阶段，添加音猬因子(SHH)或SHH激动剂可以促进神经祖细胞的腹侧化，添加糖原合成酶激酶3β抑制剂CHIR99021使WNT1-Lmx1a/Msx信号通路激活，促进神经祖细胞的后端化。上述这两种效应均呈剂量依赖性，确保神经干细胞不分化为前脑、后脑和脊髓等其他区域的神经祖细胞[26-27]。
第三阶段为中脑多巴胺能神经祖细胞终末分化，确保分化为成熟的中脑多巴胺能神经元。目前的分化方案均添加脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子等，促进中脑多巴胺能神经元的成熟[28]。中脑多巴胺能神经元分为A8、A9、A10亚群，所有中脑多巴胺能神经元均起源于中脑底板室带区的神经祖细胞，但祖细胞阶段如何决定多巴胺能神经元亚群表型和功能的多样性，以及相关分子机制仍知之甚少。
2.2.3 目前诱导方案的研究进展 早期分化方案产生大量的TH+ 神经元，但没有共表达中脑多巴胺能神经元的两种转录因子FOXA2和LMX1A。后续方案在正确指定中脑多巴胺能神经元的基础上，用SHH和FGF8处理后表达出LMX1A，得到的培养物含有50%TH+ 神经元，其中大部分共表达中脑多巴胺能神经元标记，如 LMX1B、NURR1、PITX3和DAT。还有方案添加GSK3β 抑制剂，其可有效产生人多能干细胞源中脑多巴胺能神经元，培养物中有80%FOXA2+ 细胞和75%TH+ 细胞[29]。最近一项研究由Kirkeby小组[20]提出，分阶段的应用 FGF8b可修饰人胚胎干细胞衍生的多巴胺能祖细胞向尾部腹侧中脑细胞分化。
2.3 中脑多巴胺能神经元亚型分化的机制研究现状 中脑多巴胺能神经元包括3个亚型：A8，A9和A10亚群。A8 亚群位于红核后区(retrorubral field，RrF);A9亚群位于黑质致密部(substantia nigra compacta，SNc);A10亚群位于腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)。当前对A9、A10亚型多巴胺能神经元的起源及功能研究较多，SNc/A9多巴胺能神经元主要表达Aldh1a1和Girk2/ KCNJ6，而VTA/A10神经元主要表达钙结合蛋白Calb1， Calb2(calbindin 1和2)和Cck(胆囊收缩素)。这3种亚型的多巴胺能神经元纤维分别投射到不同脑区，产生不同的生理功能[30]。仅有黑质致密部A9多巴胺能神经元变性引起帕金森病。A9和A10神经元共同起源于中脑底板室带同一位置的放射状胶质细胞，神经多巴胺能祖细胞早期分化为A9神经元，晚期分化为A10神经元。上述现象提示中脑多巴胺能神经元亚型的决定因素是在神经祖细胞形成之后的发育阶段中。
体内动物发育模型中，调控中脑多巴胺能神经元亚群的发育分子机制归纳为以下6个方面：①SOX6 和 OTX2协调作用，调控神经祖细胞，产生不同的亚群;其中SOX6对神经元亚型分化的调控作用已经在大脑皮质中间神经元和胃多巴胺能神经元等神经发育中得到体现。SOX6是第一个调控肠神经系统单一多巴胺能神经元亚型发育的转录因子[31-32];②Pitx3和En1协调作用，调控正在有丝分裂的多巴胺能神经元，产生不同的亚群;③Rspo2调节WNT信号通路，减轻黑质A9神经元的易损性;④Ahd2具有解毒功能，抵抗黑质A9神经元变性，保护神经元;⑤Mest通过WNT信号通路影响黑 质 A9 神经元发育;⑥ NeuroD1 和 NeuroD6 调 控 VTA/A10神经元的发生。目前分化方案主要是集中在提高神经多巴胺能祖细胞的表达阶段，对如何调控祖细胞分化为多巴胺能神经元亚型的研究较少[33-34]。
2.4 人多能干细胞向中脑多巴胺能神经分化过程中的异质性研究进展 尽管人多能干细胞替代疗法治疗帕金森病已经迈出了进入临床阶段的第一步，但目前仍然存在诸多需要进一步优化解决的问题，在体内，中脑神经管室带中的神经干细胞放射迁移至中间带，在此发育为神经囊胚，继续迁移至边缘带发育为A9多巴胺能神经元，并正切迁移至黑质致密部，该部位细胞类型一致，呈现“均一性”。这个过程需要各种成形素在时间和空间上精密调控才能完成[35]。在体外，尚无分化方案能达到如此“均一性”分化。虽然在过去几年中，人多能干细胞产生诱导性多巴胺能神经元已取得了实质性进展[36-37]，产生的仍是多巴胺能神经元和其他非典型的细胞类型的混合物[11，38-39]。这种异质性可以引起移植后宿主体内肿瘤形成、异动症的发生，给患者带来了潜在的、不可预估的安全风险[40]。目前大多数的分化方案，获得SNc/A9多巴胺能神经元的效率多在40%-50%之间，最高达到 75%[18]。综上，如果要解决这些难点，均无法回避一个核心问题，即现有的分化方案并不十分完美，人多能干细胞源多巴胺能神经分化产物中存在“异质性”，有进一步优化的必要性。
目前的研究热点集中在除中脑多巴胺能神经元以外的其他类型细胞鉴定、产生原因和如何清除等方面。研究显示，在目前不断优化的通用方案调控下，分化产物中其他类型细胞主要是丘脑底核的5-羟色胺神经元[11，17，39-40]，主要原因是目前认定的中脑多巴胺能神经祖细胞既可以产生中脑多巴胺能神经元，又可以产生 5-羟色胺神经元。Xia等[11]建立了拥有酪氨酸羟化酶 (TH)-RFP(红色荧光蛋白)报道基因的人胚胎干细胞系，使用这个TH-RFP报道细胞系能够从异质培养物中纯化中脑多巴胺样神经元。Nolbrant等[17]提供了一个详细的 16 d分化方案，以获得高纯度的腹侧中脑多巴胺祖细胞，用于在动物模型中的大脑内移植，该方案有助于在不同实验室和各种人胚胎干细胞系统中实施。Samata 等[39]表示人诱导多能干细胞衍生的供体细胞不可避免有致瘤性或异质细胞。为了消除这些异质细胞，已经开发了使用针对特定标记物如CORIN或ALCAM抗体的细胞分选，但是这两种标记物对于腹侧中脑都不是特异性的。实验小组对表达CORIN和LMX1A阳性细胞采用双重选择策略，并报道细胞表面标记LRTM1以富集中脑多巴胺能祖细胞。当移植到6-羟基多巴胺损伤大鼠体内时，人诱导多能干细胞衍生的LRTM1+ 细胞在体内存活并分化成中脑多巴胺能神经元，运动行为显著改善且没有肿瘤形成。Kee等[40]运用单细胞分析揭示分化的多巴胺和丘脑底核神经元谱系之间的密切关系，表示单细胞 RNA-seq可以重建LMX1A+神经元发生发展，同时 LMX1A+ 群包含不同的中脑多巴胺和STN谱系，其中 STN和中脑多巴胺谱系相关但又有截然不同的转录因子谱，应用不同的标记可以帮助优化人胚胎干细胞衍生的中脑多巴胺能神经祖细胞的分化。目前正在寻找特异性更强的中脑多巴胺能神经祖细胞抗体标记物或荧光标记的报道基因配合流式细胞仪筛选，以清除分化产物中的5-羟色胺神经元[11，20，40-41]。
然而，分化异质性的另一方面，由中脑多巴胺能神经元不同亚群引起的异质性尚未引起足够重视。体外培养和体内移植实验均证实，在同一分化方案、同一移植宿主中，人多能干细胞可以同时分化SNc/A9和VTA/A10 亚型两种多巴胺能神经元[17-18，41]。
3 讨论 Discussion
对帕金森病患者而言，并非所有中脑的多巴胺能神经元都有效。帕金森病动物模型实验证实，SNc/A9和 VTA/A10多巴胺能神经元纤维保持发育时的投射倾向， A9多巴胺能神经元的神经纤维投射至纹状体背外侧， A10多巴胺能神经元的神经纤维投射至额叶皮质;只有黑质致密部的A9多巴胺能神经元移植才能在宿主体内重新建立广泛的终端神经网络，整合去神经支配的纹状体，促进肢体运动功能恢复[17]。
解决策略一：寻找可以特异性分化为A9多巴胺能神经元的神经祖细胞标记物，之后对神经祖细胞进行流式细胞仪筛选。Sundberg小组[42]采用流式细胞术除去不需要的细胞类型并富集中脑多巴胺能神经元或其亚型。从中脑底板方案分化的人多能干细胞群体中分选 NCAM+ CD29low细胞以去除非神经致瘤细胞并富集 FOXA2+ ，LMX1A+ 和TH+ 神经元，这些细胞的移植促进了帕金森动物模型的行为恢复。Doi小组[21]用CORIN分选，移植表达中脑多巴胺标记FOXA2、LMX1A的诱导细胞，其在6-羟基多巴胺损伤的大鼠体内存活并诱导行为恢复而没有肿瘤形成。但是，一方面目前尚未找到能产生中脑多巴胺能神经元的特异性神经祖细胞标记物[43]，离临床实践仍有较远的距离。另一方面流式细胞仪的筛选尚有许多需要进一步解决的问题，如标记的方法是否影响细胞后续的培养，细胞是否能够耐受长时间接触氧气和二氧化碳，机器的无菌情况等各个方面，限制了广泛的临床使用。
解决策略二：精细地调整分化方案，针对性的提高 A9多巴胺能神经元产量，可以从根本上解决异质性问题。Fasano小组[44]发现在神经诱导期间使用高水平的 SHH对于底板特征是关键的;Andersson小组[45]证实 WNT/β-catenin信号传导是中脑多巴胺能神经元发育中的必需途径;在实验中加入GSK3β抑制剂可以有效产生人多能干细胞衍生的中脑多巴胺能神经元，其中含 80%FOXA2+ 细胞和75%TH+ 细胞[43，46]。Doi小组[21]研究使用层粘连蛋白511-E8在中脑底板诱导期间促进人多能干细胞衍生细胞的黏附。最近一项研究中，Kirkeby 小组[20]应用一组预测性标记物，可帮助改进分化方案并改善基于人胚胎干细胞治疗帕金森病模型的移植效果，人胚胎干细胞衍生的多巴胺能祖细胞的共同标记物与移植结果相关性小，而尾部的中脑标记物与移植后的多巴胺能神经元在体内的产量具有相关性，同时在诱导人胚胎干细胞向多巴胺能祖细胞分化过程中分阶段应用 FGF8b，可修饰人胚胎干细胞衍生多巴胺能祖细胞向尾部腹侧中脑细胞分化。以上分化方案设计重点均集中在通过各种手段提高中脑多巴胺能祖细胞的表达[17，24，36]。但是目前对如何定向调控相关细胞因子表达来提高A9 多巴胺能神经元产量及机制仍然知之甚少，亟待更加深入研究。
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