发布时间：2019-12-18所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 摘要 将禽流感病毒 H7 亚型标准抗原作为免疫原免疫 BALB/c 小鼠，取免疫合格的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。通过血凝抑制试验，筛选得到 12 株杂交瘤细胞上清具有 HI 效价，且与禽流感病毒 H7 亚型阳性血清间具有较好的竞争效果。将竞争效果最好的 1H
摘要 将禽流感病毒 H7 亚型标准抗原作为免疫原免疫 BALB/c 小鼠，取免疫合格的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。通过血凝抑制试验，筛选得到 12 株杂交瘤细胞上清具有 HI 效价，且与禽流感病毒 H7 亚型阳性血清间具有较好的竞争效果。将竞争效果最好的 1H11 细胞扩大培养后制备腹水，获得的单克隆抗体具有效价高、特异性好等特点。使用 H7 标准抗原包被 ELISA 板，将 HRP 标记的单克隆抗体作为竞争抗体，建立了一种禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测方法。利用该方法对待检血清进行测试，与 HI 试验有 99.3%的符合率，说明试制的禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒可以用来检测禽流感病毒 H7 亚型抗体，且操作简便快捷，可批量操作，大样本检测鸡群抗体水平。
关键词 禽流感病毒 H7 亚型;单克隆抗体;竞争 ELISA;抗体检测
禽流感是由禽 流感病毒 (Avian Influenza Virus，AIV)引起的一种急性呼吸道传染病，具有传染性强、传播速度快、抗原易变异等特点[1]。自 2013 年春天在长三角地区出现新型 H7N9 病毒疫情以来，冬春季节交替时人感染 H7N9 病毒的病例每年都有发生[2- 3]。该病毒在我国活禽交易市场及养禽农场的感染范围不断扩大，2017 年 3- 6 月，在湖南、河北、河南、天津、山西、黑龙江和内蒙古等省份均有家禽感染高致病性 H7N9 病毒的报道。自疫情暴发以来，约 6 万羽家禽感染，30 万羽家禽遭扑杀。多家兽医机构监测结果均表明，我国 H7N9 亚型流感病毒的养殖场阳性率和个体阳性率在总体上均呈现逐年上升趋势，对家禽养殖业和公共卫生安全造成了严重威胁[4- 5]。国家禽流感参考实验室采用反向遗传技术，研制出重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re- 8 株 +H7N9 H7- Re- 1 株)，通过深入调查研究和专家论证，农业部决定先行在广东省和广西壮族自治区对该疫苗进行试点性应用，再进一步在全国范围内进行推广，为有效控制 H7N9 病毒的蔓延奠定了基础。常规检测禽流感病毒抗体的方法是血凝抑制(HI)试验，HI 试验对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果判定也有较强的主观性。因此，研制一种禽流感 H7 亚型抗体检测方法对评价疫苗免疫效果和及时监测鸡群抗体水平显得极为重要。
1 材料与方法
1.1 细胞与试验动物
多发性骨髓瘤细胞(SP2/0)来源于农业微生物学国家重点实验室，由武汉科前生物股份有限公司保存备用，BALB/c 小鼠购于湖北省实验动物研究中心。
1.2 主要试剂与试剂盒
RPMI- 1640 购 自 HyClone，50% PEG1450 (P7181)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG、50× HAT(A：氨基蝶呤)、100×HT(H：次黄嘌呤和 T：胸腺嘧啶核苷)、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自 Sigma 公司，青链霉素(100×)、胎牛血清购自 Gibco 公司。禽流感病毒 H7 亚型血凝抑制试验抗原，加入 2 mL pH 值 7.4 的 PBS 溶解作为免疫原。
1.3 禽流感病毒 H7 亚型单克隆抗体的制备
1)按照常规方法进行动物免疫。三免后 14 d，尾静脉采血，间接 ELISA 测定血清效价。选择效价最高的小鼠进行加强免疫。免疫后第 3 天，进行细胞融合。
2)按照常规方法进行细胞融合。采用间接 ELISA 对杂交瘤细胞上清进行筛选。阳性孔再经过 3 次有限稀释法进行亚克隆，待阳性率达到 100%时扩大培养，用于制备腹水，并保存于液氮。参照文献进行腹水的制备，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心取上清[6]。
1.4 禽流感病毒 H7 亚型抗体竞争 ELISA 检测方法的建立
1)竞争 ELISA 抗体检测方法的初步建立。将获得的具有竞争效果的单抗纯化酶标后，初步建立竞争 ELISA 抗体检测方法。
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2)特异性试验。用试制试剂盒分别对 5 份禽流感病毒 H7 亚型抗体阴性血清、禽流感病毒 H5 亚型(AIV- H5) 阳 性 血 清 、 禽 流 感 病 毒 H9 亚 型(AIV- H9)阳性血清、新城疫病毒(NDV)阳性血清、传染性支气管炎病毒(IBV)阳性血清、传染性法氏囊病毒(IBDV)阳性血清进行检测，根据检测结果评价其特异性。
3)敏感性试验。选取 6 份阳性血清和阳性参考血清从 2 倍开始倍比稀释至 64 倍，分别用 3 批禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒和 HI 试验 2 种方法检测。当待检血清的 HI 抗体效价稀释至 4log2 时 (HI 试验判定标准：当 HI 抗体效价≥4log2，判为阳性;HI 抗体效价<4log2，判为阴性)，对应试制试剂盒检测的 PI 值应≥40%，以此来评价试制试剂盒的敏感性。
4)与 HI 试验符合率比较试验。与 HI 试验同时检测 150 份样品，比较 2 种方法检测结果的符合率。
2 结果与分析
2.1 单克隆抗体的筛选
对阳性杂交瘤细胞株所分泌的上清做竞争效果的筛选，其中阳性血清的 OD450 nm 值用“P”表示，阴性血清细胞上清的 OD450 nm 值用“N”表示，当 N/P 值越大时，细胞上清的竞争效果越好。试验结果表明，1H11 细胞株所对应的抗体 N/P 值最大，竞争效果最佳(表 1)。
2.2 竞争 ELISA 抗体检测方法的初步建立
使用方阵滴定试验摸索包被抗原和酶标抗体的稀释滴度。将抗原按 1∶400、1∶800、1∶1 000、1∶ 1 200、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000 进行稀释，分别加入到酶标板的第 1~8 行，每个稀释度加 1 行，每孔 100 μL。将酶标记抗体按 1∶400、1∶ 600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500 进行稀释，分别加入酶标板的第 1~6 列 /7~12 列，每个稀释度加 1 列，每列 100 μL。按照竞争 ELISA 的常规步骤进行操作[7]，方阵滴定结果见表 2。当抗原 1∶1 000 稀释、酶标记物 1∶1 000 稀释时，阳性对照 PI 值最大，因此，选择抗原最佳包被浓度为 1∶1 000 稀释(每孔抗原包被量含量为 2 μg/mL)、酶标记物最佳稀释倍数为 1∶1 000，其 N/P 值最大(表 3)。
2.3 特异性试验
用试制的禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒检测 5 份禽流感病毒 H7 亚型抗体阴性血清，结果均为阴性(表 4);检测常见禽病的阳性血清，检测结果均为阴性(表 5)，说明该试剂盒与其他常见禽病的阳性血清均无血清学交叉反应。以上结果表明，试制的禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒具有良好的特异性，可用于血清中禽流感病毒 H7 亚型抗体检测。
2.4 敏感性试验
用试制的 3 批禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒和 HI 试验 2 种方法检测 7 份血清。将阳性血清 6 份和阳性参考血清从 2 倍开始倍比稀释至 64 倍，用 HI 试验和试制的试剂盒 2 种方法分别检测血清效价，结果基本一致。说明试制的禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒具有良好的敏感性，可以用来检测禽流感病毒 H7 亚型抗体(表 6)。
2.5 与 HI 试验符合率比较试验
将试制的禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒与 HI 试验同时检测鸡血清 150 份，禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒检测为阳性 28 份，阴性 122 份，HI 试验检测为阳性 27 份，阴性 123 份。试制的试剂盒与血凝抑制试验相比，符合率为 99.3%(表 7)。试制的试剂盒与血凝抑制试验的符合率较高，由此也证实了所研制的试剂盒在检测鸡血清中禽流感病毒 H7 亚型抗体的可靠性。
3 讨 论
目前，关于 H7 亚型禽流感病毒单克隆抗体的应用相继有报道，主要是在胶体金试纸条、间接免疫荧光、免疫组化等方面的应用[8- 9]。在本研究中，制备了 12 株特异性针对 H7 亚型禽流感病毒的单克隆抗体，并通过竞争 ELISA 方法筛选 1 株具有较好血凝抑制作用的 1H11 细胞株，制备并纯化得到单克隆抗体，建立了 1 种应用于评价抗 H7 亚型禽流感病毒血清抗体水平的竞争 ELISA 抗体检测方法，试制了试剂盒。用试制的禽流感病毒 H7 亚型竞争 ELISA 抗体检测试剂盒检测 150 份血清样品，并且与 HI 试验进行比较，符合率为 99.3%;选取 6 份禽流感病毒 H7 亚型 HI 抗体效价≥9log2 和阳性参考血清同时进行敏感性检测，结果表明试制试剂盒与 HI 试验敏感性一致;检测禽流感病毒 H5 亚型(AIV- H5)、禽流感病毒 H9 亚型(AIV- H9)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)阳性血清均为阴性，检测已知无禽流感病毒 H7 亚型感染的血清全部为阴性，证明试剂盒特异性良好。
该方法操作简便快捷，可批量操作，大样本检测鸡群抗体水平，为 H7 禽流感病毒的免疫水平监测提供依据。在我国，高致病性禽流感病毒的免疫防控策略是通过灭活疫苗的免疫维持鸡群中高抗体水平，鸡群中抗体水平的检测主要依赖于血凝抑制试验，对试验者专业要求高，且工作量大，不利于大规模开展抗体监测。竞争 ELISA 抗体检测方法的使用可很好地替代血凝抑制试验，操作简便快捷，适用于大规模进行田间检测 H7 亚型禽流感病毒的抗体水平，对鸡群及时、精准的免疫提供指导意义。
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