发布时间：2020-02-22所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： 摘要背景：组织工程骨为修复极限骨缺损提供了新的选择，但只有先形成完善的功能性血管网，保证稳定的成骨和骨整合，才能取得良好的治疗效果。因此，血管化可以说是组织工程骨面临的最大挑战与难题。目的：探讨体外联合应用血管内皮生长因子(vascularendothel
摘要背景：组织工程骨为修复极限骨缺损提供了新的选择，但只有先形成完善的功能性血管网，保证稳定的成骨和骨整合，才能取得良好的治疗效果。因此，血管化可以说是组织工程骨面临的最大挑战与难题。目的：探讨体外联合应用血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和血小板衍生生长因子BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)对骨髓间充质干细胞增殖和成血管能力的影响。方法：体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，分别用不同质量浓度VEGF(20，40，60，80，100，120μg/L)、PDGF-BB(20，40，60，80，100，120μg/L)联合干预以及100μg/LVEGF单独干预、100μg/LPDGF-BB单独干预，CCK-8实验检测2种细胞因子促进细胞增殖的最佳质量浓度，然后在第7天和第14天通过RT-PCR方法检测血管生成素1、缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子等相关成血管基因的表达量。结果与结论：①加入生长因子后，细胞增殖能力明显提高，联合作用效果更优，最佳组合为80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB;②VEGF、PDGF-BB都可以促进血管生成素1、缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的mRNA表达，联合应用时效果最佳;③缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子mRNA表达随时间延长有所升高，差异有显著性意义(P<0.05);而血管生成素1、胰岛素样生长因子mRNA表达量随时间延长有所降低，差异有显著性意义(P<0.05);④体外实验结果证明，当VEGF和PDGF-BB质量浓度均为80μg/L时，能够持续稳定促进整个血管形成过程，且促进作用优于单独一种生长因子。
关键词：骨髓间充质干细胞;血管内皮生长因子;血小板衍生生长因子BB;组织工程骨;血管化
0引言Introduction
口腔颌面部大段骨缺损修复一直是口腔临床治疗的难题[1]。组织工程骨的问世为修复极限骨缺损提供了新的选择，然而在临床应用过程中，只有先形成完善的功能性血管网克服扩散限制[2]，保证稳定的成骨和骨整合，才能取得良好的临床治疗效果[3]。因此，血管化可以说是组织工程骨面临的最大挑战与难题[4]。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是目前促血管生成能力最强的生长因子，多位学者研究发现单独大剂量使用外源性VEGF时可有效促使内皮细胞通过芽生方式连结为血管内膜腔，但是其促生的血管结构较为幼稚，缺乏成熟血管的基底膜和周细胞[5]。血小板衍生生长因子BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)是强力促分裂剂，作用于管周细胞，能促进血管成熟[6]。二者单独作用都对血管化起推动作用，然而联合使用研究较少，且对于联合应用后相互拮抗还是相互促进用，一直存在争议[7];另一方面，联合应用生长因子促进成血管时，其合适的比例及作用浓度也非常重要[8]。
期刊推荐：《分子细胞生物学报》是1936年由中国科学院、上海生命科学研究院等单位主办的期刊。主要刊登分子细胞生物学领域,包括细胞生物学、发育生物学、生殖生物学、肿瘤生物学和免疫生物学等方面的创新性研究论文、研究简报和特约综述等,为中国自然科学核心期刊之一。
该研究联合应用不同质量浓度VEGF和PDGF-BB对骨髓间充质干细胞进行培养，旨在研究二者对骨髓间充质干细胞增殖及成血管的影响，并确定最佳质量浓度组合，希望能够诱导产生更加成熟稳定的血管网，遴选更加优质的组织工程骨种子细胞。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计随机对照细胞实验。
1.2时间及地点实验于2017年12月至2019年5月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。
1.3材料
1.3.1实验动物SD大鼠20只，3周龄，雌雄不限，体质量40-50g，由新疆医科大学第一附属医院动物中心提供。1.3.2实验试剂和仪器α-MEM(Hyclone，美国);PDGF-BB(R&D，美国);VEGF(PERROTECH，美国);CCK-8(DOJINDO，日本);倒置相差显微镜以及照相系统(莱卡，德国);酶联免疫仪(THERMOFISHERSCIENTIFIC，美国);RT-PCR仪(BIO-RAD，美国);QuantiFast®SYBR®GreenPCRKit(QIAGEN公司，德国);胎牛血清(四季青，中国)。
1.4实验方法
1.4.1骨髓间充质干细胞的培养SD大鼠脱颈后处死，取股骨及胫骨，剪去骨骺端，反复冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，离心后弃上清，加入α-MEM培养液均匀分装至T25细胞培养瓶，放入细胞培养箱，3d后换液，7d传代。取状态良好的第3代细胞消化制成细胞悬液并计数备用。
1.4.2实验分组及干预取第3代骨髓间充质干细胞，以2×105密度接种于6孔板，每孔2.5mL;以2×103密度接种于96孔板，每孔0.1mL。用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养24h使细胞贴壁，吸弃原培养基，换成含不同质量浓度细胞因子及体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，此后每隔3d半量换液，每隔7d全量换液，每次换液均重新补充相应体积的生长因子，其中实验1组加入100μg/LVEGF;实验2组加入100μg/LPDGF-BB;实验3组加入20μg/LVEGF+20μg/LPDGF-BB;实验4组加入40μg/LVEGF+40μg/LPDGF-BB;实验5组加入60μg/LVEGF+60μg/LPDGF-BB;实验6组：加入80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB;实验7组加入100μg/LVEGF+100μg/LPDGF-BB;实验8组加入120μg/LVEGF+120μg/LPDGF-BB;对照组加入同等体积PBS。
1.5主要观察指标
1.5.1CCK-8法检测细胞增殖率细胞因子干预24h后，取1个96孔板进行CCK-8实验，弃去原培养基，PBS洗涤1次，加入用a-MEM培养基稀释的10%CCK-8溶液，每孔100μL，37℃孵育4h，450nm波长检测吸光度值，确定细胞生长因子促骨髓间充质干细胞增殖的最佳质量浓度。每组4个样本，实验重复3次。接下来每天于固定时间取1个96孔板，在同一台酶联免疫仪上测吸光度值，确定细胞生长因子促骨髓间充质干细胞增殖的最佳作用时间。
1.5.2细胞形态观察倒置相差显微镜下观察各组细胞数量、形态及排列有无变化。
1.5.3RT-PCR检测成血管基因表达细胞因子干预第7，14天，采用RT-PCR检测成血管基因血管生成素1、缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的表达水平。参照PubmedGeneBank中的基因序列，设计相关基因引物，所有引物由上海生工公司合成。用TRIzol法提取RNA，紫外分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。取待测样品总RNA100ng，按照说明书进行反转录反应合成cDNA。将生成的cDNA稀释成100mg/L，取2μL稀释后的cDNA进行RT-PCR反应。配制成20μLPCR反应体系：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10μL，ForwardPrimer1μL，ReversePrimer1μL，cDNA模板2μL，RNase-FreeddH2O6μL。PCR反应条件为95℃、2min循环1次;95℃、5s循40次;60℃、10s循环40次，最后进入熔解曲线。成血管基因引物序列，见表1。
1.6统计学分析应用SPSS22.0软件进行处理，数据以x_±s表示，确定最佳作用时间的4组细胞增殖率均数间比较采用2×2析因设计的方差分析，检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有显著性意义;将成血管基因在第7天和第14天的表达量进行重复测量检验，若其满足球对称性时，采用重复测量的单变量方差分析法，否则采用球对称系数ε对自由度进行校正。
2结果Results
2.1确定细胞生长因子促细胞增殖的最佳质量浓度通过CCK-8试剂盒检测不同质量浓度生长因子对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。实验结果显示联合应用2种生长因子对骨髓间充质干细胞增殖的促进作用最强，且呈现剂量效应关系，最佳组合为80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB，继续增加质量浓度后细胞增殖率变化不大，见图1。因此，采用100μg/LVEGF组、100μg/LPDGF-BB组、80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB、对照组进行后续实验。
2.2确定细胞生长因子促细胞增殖的最佳作用时间从图2可以看出，对照组细胞增殖率随着时间的延长仅有轻微增长，第6天已经进入细胞增殖停滞期，第7天时细胞增殖率显著下降;其他3个实验组随着时间的延长，细胞呈指数增长，表现为较好的增殖活性，均在第6天时达到最佳的促增殖效果，提示细胞生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖存在时间依赖效应，第7天时各实验组细胞增殖率均明显降低，原因可能与细胞衰老退化性能降低以及细胞生长因子存在半衰期有关。
在连续7d的观测时间内，除了第7天，其他时间点3个实验组的细胞增殖率均远超对照组。VEGF+PDGF-BB组促细胞增殖效率最好，PDGF-BB组次之，VEGF组最差。第5，6天时，VEGF+PDGF-BB组促细胞增殖效率明显高于PDGF-BB组和VEGF组，PDGF-BB组与VEGF组无显著差异。第7天时，VEGF组、PDGF-BB组、对照组细胞增殖率接近，而VEGF+PDGF-BB组细胞增殖率依然较高，结合前期阅读的大量文献，选取7d作为最佳时间点，用于后续实验。
2.3骨髓间充质干细胞的形态变化在倒置相差显微镜下观察，最佳浓度生长因子干预7d后，实验组细胞形态向内皮细胞分化：数量增多、体积变大、形态变长、伸出圆凸状长触角[9]，开始时呈现聚集趋势，然后逐渐呈点状、条带状、横向变宽并有纵向连接趋势排列似渔网状，以上均提示加入因子后细胞成管能力增强，见图3。
2.4RT-PCR检测成血管基因表达在相应的时间点，分别检测血管生成素1、缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子这4个成血管相关基因表达量，各实验组与对照组相比成血管基因的表达均有所增加，差异有显著性意义(P<0.05)，在以上4个成血管相关基因的mRNA表达上，VEGF主效应、PDGF-BB主效应、VEGF和PDGF-BB的交互效应差异均有显著性意义(P<0.05)。VEGF、PDGF-BB都可以促进血管生成素1、缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的mRNA表达，联合应用时促表达效果最佳。
通过重复测量方差分析对时间因分析发现：缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子mRNA表达随时间延长有所升高，差异有显著性意义(P<0.05);而血管生成素1、胰岛素样生长因子mRNA表达量随时间延长有所降低，差异有显著性意义(P<0.05)，结果见表2-4。
3讨论Discussion.
种子细胞是骨组织工程研究中最基本的环节，骨髓间充质干细胞应用十分普遍，也是促血管化的优选细胞，具有较强的自我增殖及分化能力，体外实验证实第3代骨髓间充质干细胞增殖、分化、迁移性能最好[10]。实验选用第3代骨髓间充质干细胞进行相关实验，避开了内皮祖细胞易于老化、培养成本低、形成血管不稳定等缺点[11]。
运用基因工程技术及基因转染技术对种子细胞进行特定改造，为达到精确表达促血管生长因子提供新路径，然而其技术敏感性高、安全性及有效性缺乏长期观察[12]。因此，实验采取直接滴入的方法加入VEGF和PDGF-BB这2种促血管生长因子，细胞与细胞、细胞与基质、细胞与细胞因子相互作用后，微观上引起特定基因表达发生变化，合成特异性蛋白;宏观上，在原血管结构的基础上长出新血管[13]。此方法简单、实用，经证实安全且有效。
鉴于在联合使用生长因子时，其浓度和比例不同，可以产生截然相反的效果。细胞增殖能力很大程度上决定了种子细胞发挥效能的程度。实验通过CCK-8法检测不同质量浓度生长因子对细胞增殖的影响，试图筛选出2种生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖的最佳质量浓度组合使其发挥最大效能，并用于后续实验。大量查阅文献后，得出单一应用VEGF或PDGF-BB最佳质量浓度是100μg/L[14-15]，该实验依次选取20-120μg/L质量浓度，结果显示：VEGF和PDGF-BB均能促进细胞增殖，联合应用效果最佳，存在浓度效应关系，最佳组合为：80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB。
血管形成是多种生长因子共同调控的结果，血管内皮细胞形成相关的信号通路包括：VEGF信号通路、PDGF-BB信号通路、TGF-β信号通路等[16]。VEGF、PDGF-BB的表达受诸多因素调节，近20年对于VEGF信号通路研究较多，该实验直接加入这2种效果最为显著且是研究热点的细胞生长因子，研究对其他成血管特异性指标的影响。缺氧诱导因子1α是调节低氧状态下多种平衡的中心环节，几乎介导多细胞动物所有有核细胞对缺氧或缺血的适应性反应，能够调节包括VEGF在内的下游基因，促进早期血管形成[17]。肝细胞生长因子的表达是血管形成前中期的重要标志性蛋白，通过减少纤维形成促进血管形成[18]。胰岛素样生长因子1主要存在于骨基质和长骨的生长面中，是骨形成过程中的调控因子，除了能促进成骨细胞增殖分化，亦能通过上调VEGF的表达从而促进血管内皮细胞的增殖、迁徙、管型形成，也是血管形成中后期的标志性蛋白[19]。血管生成素1在介导内皮细胞与细胞外基质的相互作用中起关键作用，并在血管形成的后期阶段和血管重塑阶段参与血管生成，促进血管重塑、成熟，有明确的成血管作用，为血管形成末期特异指标[20]。以上都是成血管的特异性指标，血管形成时mRNA的表达量均会上调，分别代表不同时期血管形成的程度。因此，在加入外源性VEGF和PDGF-BB后，通过检测细胞外环境中缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和血管生成素1的mRNA表达，能够反映骨髓间充质干细胞的血管化程度。缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和血管生成素1mRNA表达上调，反过来又势必会影响骨髓间充质干细胞表达VEGF和PDGF-BB，内源性加上外源性VEGF和PDGF-BB同时增加，形成一个良性循环。
从加入VEGF及PDGF-BB到其对骨髓间充质干细胞成血管调节功能发挥作用需要一定的时间，基因表达发生变化一般7-14d就能体现，因此选择7，14d这2个时间点对成血管特异性指标进行检测，缺氧诱导因子1α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和血管生成素1表达均上调，说明VEGF和PDGF-BB对血管形成的整个阶段都起到持续的促进作用。与第7天相比，第14天时所有成血管指标并不都上调，而是有增有减，又有潜在规律可循：早中期成血管指标缺氧诱导因子1α和肝细胞生长因子表达进一步增加，而中后期特异性成血管指标胰岛素样生长因子和血管生成素1表达稍降低，这也提示14d时血管形成仍处于早中期，尚未形成成熟血管网，与以往研究结论相符，以上现象都能通过复杂的成血管信号通路得到解释[21]。
综上所述，实验证明联合应用VEGF和PDGF-BB能促进骨髓间充质干细胞增殖，证实二者是相互促进的，加入PDGF-BB能促进VEGF调控形成的幼稚血管逐渐改建形成成熟功能血管网。当VEGF和PDGF-BB质量浓度均为80μg/L时，能够持续稳定促进整个血管形成过程，且促进作用优于单一应用一种生长因子，为精确使用生长因子的质量浓度和时间提供了一定参考依据。然而，成血管是一个极其复杂的过程，不同阶段需要的因子不同，是多种生长因子序贯参与、联合作用的结果。为了真正模拟体内真实环境，是否还需要在特定阶段加入其他某种或某些因子共同作用以及新的最佳质量浓度组合仍有待后续实验进一步探究，实验只检测7，14d2个观察时间点，后续还应该增加代表血管形成早期和后期的时间点，以便观察到更加完整的血管形成动态变化过程和基因表达的波动变化。除了时间，空间对于血管形成的调控作用也尤为重要，有待后续动物实验继续探讨。此外，VEGF和PDGF-BB上调缺氧诱导因子1α、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子和血管生成素1基因表达的机制仍有待深入研究。
SCISSCIAHCI
