发布时间：2021-03-31所属分类：免费文献浏览：1次
摘 要： 药物生物技术
《基于3R的实验动物病原微生物质量检测方案的考量》论文发表期刊：《药物生物技术》；发表周期：2020年03期
《基于3R的实验动物病原微生物质量检测方案的考量》论文作者信息：钟女奇(1972-07)，女，广东兴宁人，理学学士，研究方向:医学病原、微生物与细胞体外技术
摘要本文旨在总结基于3R的实验动物病原微生物质量检测方案。参考多年的实验动物病原微生物质量检测实践方法，以“检测依据、国内外状况、各单位的实际情况、3R原则、安全与质控能力”等为考量要素，制定出以“最优化的样本、标本、试剂、仪器、方法及过硬的技术与质控检测团队”进行实验动物病原微生物质量检测的实验方案。本文考察了国内外实验动物病原微生物质量检测状况及各单位的实际情况。论证了基于3R原则的实验动物病原微生物质量检测及最优化的检测方法，并分析了安全意识与质控能力的重要性。这些考量下的质量检测方法与检测结果能很好地满足实验动物病原微生物质量检测的现今要求：快速与准确，安全与高效等。该文概述了如何“基于3R的原则，在实验动物病原微生物质量检测方案制定或其它有关工作中”进行有关要素的考量，希望能为同仁们在相关工作中抛砖引玉、少走弯路、提供些经验性参考。
关键词 3R原则;实验动物;病原微生物;检测方案;质控能力;安全意识
实验动物病原微生物质量检测是实验动物健康状况与质量等级评估的重要手段之一，做好该检测工作是实验动物质量得以保障的重要内容之一。国家标准是依据国情制定实施的，是各国质量检测的主要依据、是做好质量检测工作的重要保障;但是21世纪的生命科学技术的发展日新月异[1，致使某些国家的国家标准的更新速度几乎不能与之同步，检测结果也得不到统一、出现意见分歧：质量结果的差异导致了以实验动物为研究对象的科研结果不可取[。
为了减少诸多的争议，我国于2011颁布实施了2011年版的《实验动物微生物学等级及监测》国家标准。因为切实可行的才是最好[，该标准在检测方法上并没有强制性的要求，而是建议性的指导，意在告诉大家：在进行质检前，制定切实可行的检测方案是相当必要的。通过多年的检测实践经验，笔者建议，这些方案的考量要素主要有：检测依据、国内外状况、各单位的实际情况“减少、替代、优化”的3R科学原则，安全与质控能力等等。下面笔者就这些要素进行见解性的阐述。
1检测依据
实验动物自身携带的与环境中的病原微生物并非是一成不变的[，不同国家标准要求排除的实验动物病原微生物与不同试验需求的动物所排除指标，也有不一致性的问题。这种不一致性与新技术的层出不穷，要求检测工作必须紧跟时代的前沿，用于实验动物健康与等级评估用的检测方案要进行合适的调整，对不同需求动物进行相对不同的检测指标与方法。
我国现行的2011年版《实验动物微生物学等级及监测》国家标准较切合中国国情，亦与国际现代生命科学技术的发展要求相吻合，是实验动物病原微生物质量检测工作的必要的与主要依据之一：该标准与前版相比，最大的改进是对检测方法进行了推荐性的指导，具体参见GB/T1 4926-
2001各章节，而没有强制执行要求：这给检测工作者带来了很大的灵动性。日新月异的生命科学技术，如基于ELIESA原理的液相芯片技术、实时荧光定量PCR与多重PCR技术在实验动物质量检测中的应用与发展，将是这种灵动性的最有力的体现。
2国内外实验动物病原微生物质量检测状况
目前国际上实验动物病原微生物质量标准或健康监测指导意见具有较高影响力的单位有欧洲实验动物科学协会联合会(FELASA)、美国Charles Rive Taconic公司、日本实验动物中央研究所(ICLAS)等等，它们在大小鼠病原微生物排除指标上略有差异[，分为核心检测项目与和备选的检测项目，相当于我国的必须与必要检项目。
我国实验动物国家标准(GB14922.2011)规定：实验小鼠病毒必检项目6种，必要时检测项目5种，大鼠病毒检测项目8种，全部为必检项目：实验大、小鼠病原菌必检项目8或9种，必要检测项目7或6种。与以上国外单位比较，排除指标数量上有些出入，但是大部分与它们的是一致的。在我国质量检测实行二级行为“标准：质量检测机构，硬件设施比较完善，技术比较雄厚与成熟，负责每年的年检工作与对境内外引进动物的检测，对排除指标做全面的监测。这给二级单位的动物健康状况与质量等级带来一定的保障。二级单位(实验动物繁育与生产单位)的检测行为是根据动物的免疫机制及病原微生物的特性等特点，在三个月内进行一次动物健康状况的质量自检。国家标准没有对实验动物使用单位的使用动物进行质量检测的明文规定，各实验动物使用单位可结合自身情况而为之。国际上统一的健康报告标准，将有利于实验动物病原微生物质量检测跟踪。
3各单位的实际情况
实验动物病原微生物的分布、流行及在动物身上的携带状况等情况有地域差异性和国情因素，国外知名单位也一直调强要根据实际情况制定适合的健康监测方案回在我国，行家们多知道[4：有些病原体虽然对动物有一定的危害，然而感染频率较低，如在标准中强制要求，将会造成资源的浪费。因此各实验动物生产和使用单位，应对不同来源与不同用途的实验动物采取不同的监测频率，如：繁育单元和试验单元，一般科研动物、教学动物、转基因动物，免疫机能正常与否，哨兵动物、还是生产供应或实验用动物等等，它们的检测指标与频率不是雷同的，加强转基因动物等引种动物的检测频率尤显重要2。同时要考虑病原体对动物的致病特性及年龄依赖性[1等问题。隐性感染病原微生物如：小鼠肝炎病毒、金黄色葡萄球菌、绿胀杆菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯杆菌等在感染动物后，除了没有或不明显的临床症状外，还可经人员的流动带来病原传播的危害，致使给监测带来难度。所以对这些排除病原微生物应纳入常规与高频检测项目，具体可参考文献1目的排除指标检出率的高低，取决于检测方法与质控能力。时至今日，实验动物病原微生物的检测方法多种多样[，如PCR就有7种以上：PCR方法比分离培养法检出阳性率要高、敏感、检测耗时少，但是PCR法也存在易污染、DNA提取失败等情况：EISA是血清学中的一种方法，其精确性、重复性都较高。一般来说，血清学的检出率要高，可检测的是抗体或病原体，但有时段限制。因此在平时的诊断检测中，可将两种或三种方法结合：在样品量较少时，可优先使用分离培养法或ELISA法而在大规模检测、需要快速诊断时，可优先考虑PCR方法。总之检测方法的选择与应用，没有绝对的定论，也要根据各实验动物生产和使用单位的具体情况，如检测量、经费与、技术与质控能力等去考量。总之，在制定日常实验动物健康状况与质量等级评估的检测方案时应依据各自的实际情况，量力而行。
4基于3R原则的实验动物病原微生物质量检测在实验动物福利的基础上做好微生物质量定期检测是实验动物质量控制的有力保证D]：好的实验动物病原微生物质量检测方案与3R原则之间存在紧密联系[.3R原则于1959年由英国动物学家William Russell和微生物学家Rex Burch提出，以后在动物生产与使用及管理中被广泛应用，并不断发展，也是多年来一线检测工作者努力追求的目标，因为快速、准确是质量检测结果的首要素，特异、灵敏又是准确结果的必备条件，高效、安全又是相关单位和一线检测工作者追求的目标，3R原则在实验动物病原微生物质量检测中的良好应用，势必给各个单位及社会带来很好的效益与环保。
3R三要素是相辅相成的、互相促进的：好的实验动物病原微生物质量检测方案应是立足本国、放眼世界、结合自身实际情况的：检测频率、指标、样本、操作程序等在科学前提下，尽量达到最少或最简便与易行：取样尽量达到体外进行或哨兵动物[1，检测方法上达到最优化。
5最优化的检测方法
快速、准确、安全、高效的检测结果是现今实验动物病原微生物质量检测必须的要求。准确表现为在结果最接近真值，即检测结果是真值与误差的混合体，只有优化各种减少误差的因素，如：试剂、方法、仪器、技术(操作能力)与质控能力等等，才能将误差降到最低，甚至为零。
传统的分离培养与生化鉴定虽说是金标法，但对于非野生型有些特性不一定符合国标描述的要求，因变异造成对营养、温度、气体环境的要求不一，导致在药物筛选培养基中出现的菌落特征有差异与菌体形态的变化(如L-型等)，甚至生化反应也不一致：如纯粹用单一方法去评判结果，是必草率了：再者传统的分离培养与生化鉴定费时又耗力，除了基层单位，在经济发达地区与高校等的检测部门，在大量抽样检测时几乎不被多用。
二十一世纪生命科学技术高速发展，ELISA与PCR技术及其衍生技术已发展地相当成熟2，其因其灵敏度都相当高(可达到Pg)，特异性、准确也相当高，进而被多数检测实验室所采纳与应用，也是国标所规定或允许的。但是ELIESA检测的是单一的蛋白成分，检测中难免会漏检，造成假阴性：而PCR技术检测的是核酸，检测时所选的是各目的指标的保守基因片段对应的特异性引物，所以PCR的特异性又比ELISA强许多，不受物种变异的影响。如今市场化的现代高质商品：实时荧光定量PCR与ELISA试剂盒及其对应的仪器，具有相当的普遍性。西山生物技术有限公司的实时荧光定量PCR与ELIS试剂盒，Light Cycler实时荧光定量PCR仪、全自动核酸提取仪，在实验动物质量检测界赢有较高的知名度与信誉度。如能在检测中将这些自动化仪器、设备有机地组合以达到最优化，并进行有效的质控，那检测结果将不言而预。
随着现代检测要求的不断深化，ELISA的衍生技术一液相芯片技术与PCR的衍生技术一多重PCR技术，因其除了具备之前的特异、灵敏、快速、准确、一次能检测多个样本的特性外，还能一个样本一次检测多个指标，大大提高了效率，能满足繁重的实验动物病原微生物质量检测的现代要求，进而被多数检测专家认可与应用[
6安全意识与质控能力的重要性
安全对于一线检测工作人员与环保是颇为重要的，是检测人员在检测时首要考虑的要素。实验动物病原微生物质量检测涉及到的安全问题主要在实验室，危害来源主要是病原微生物与检测中所用到的化学试剂，检测前必须强烈的安全意识之，做好检测中的生物安全控制与预防。在细菌方面，笔者在《实验动物细菌检测中的生物安全控制与预防》一文中进行了较详细的归纳"：至于其它微生物的危害可参见有关文献[2：目前商品试剂盒很多，在购买时要选优化良好的、对人体危害最小的、对环境危害能做有效控制的试剂。比如目前在PCR操作中，核酸提取有传统的手工提取与核酸自动提取仪提取：最好使用仪器自动提取，因为手工提取试剂盒中的有些有机试剂的危害是很明显的，特别是病毒核酸提取试剂盒，如MHV核酸提取用到的裂解液等：在进行大量样本的核酸抽提过程中，潜在危害是不可忽视的!选择合适的操作技术，更有利于检测工作的安全控制与预防。质控在疾病诊断中占据重要的地位，在实验动物病原微生物质量检测中也尤显重要，因为检测结果是质量的评判标准，而结果包含了真值与误差，质控的目的是将误差降到最小，所以质控能力在检测方案制定时也不可忽视。在技术与质控团队中要优化各种组合，以利检测结果的真实性的体现。
总之，基于3R原则的实验动物病原微生物质量检测方案的最佳考量结果应是: 最优化的样本、标本、试剂、仪器、方法、技术够硬的检测与质控团队的完美组合。
参 考 文 献
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Abstract To summarize the 3R-hased experimental animal pathogen micrbial quality testing program. Referring to many years of practical methods for the quality testing of pathogenic microorganisms in experimental animals, taking "testing basis, domestic ano foreign conditions, actual situation of each unit, 3R principle, safety and quality control ability"as the consideration elements, we have developed an "optimized sample, sample , reagent, instrument , method and excellent technology and quality control testing team"experimental scheme for the quality testing of pathogenic microorganisms in experimental animals. This aticle investigated the status of domestic and foreign laboratory animal pathogenic microorganism quality testing and the actual situation of each unit, demonstrater the quality of laboratory animal pathogenic microorganisms and the optimal detection method based on the 3R principle, and analvze the importance of safety awareness and quality control capabilities. The quality testing methods and test results under these considerations can well meet the current requirements for the quality testing of pathogenic microoranisms in laboratory animals: fas and accurate, safe and efficient. This article outlines how to carry out the consideration of relevant elements "based on the principle of 3R in the formulation of laboratory animal pathogen microbiological quality testing programs or other related work", hoping to help colleagues in the relevant work Some empirical references.
Key words 3R principle; laboratory animals : pathogenic microorganisms detection scheme; quality control ability ; safety awareness
SCISSCIAHCI
