发布时间：2021-09-13所属分类：免费文献浏览：1次
摘 要： 中国病原生物学杂志
《呼吸道合胞病毒感染患儿临床特征及免疫功能分析》论文发表期刊：《中国病原生物学杂志》；发表周期：2021年04期
《呼吸道合胞病毒感染患儿临床特征及免疫功能分析》论文作者信息：褚丽敏（1980-），女，河北邯郸人，医学学士，河北医科大学第一医院副主任护师。研究方向：呼吸系统。
【摘要】目的 分析呼吸道合胞病毒(RSV)感染患儿的临床特征及免疫功能，为临床抗感染提供指导。方法 选取68例呼吸道感染患儿为观察组，74例健康体检儿童为对照组，分析感染患儿免疫球蛋白和T细胞亚群水平。收集呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物样本，采用直接荧光定性检测样本中病毒，PCR扩增检测RSV临床分型。结果 68例呼吸道感染患者中，感染呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、流感病毒、肠道病毒、混合型的患者分别为36、11.9、7，3和2例。36例RSV感染患儿中，A亚型26例，B亚型10例。男性患儿25例，女性患儿11例。0~、1~、3~和6~14岁组患儿检出率分别为36.11%，27.78%，22.22%和13.89%，0-1岁组与其他年龄组相比，差异有统计学意义(x2=5.5556，F=0.0184)，RSVA和RSVB在不同年龄呼吸道感染患儿中均有分布。春夏秋冬四季患儿RSV检出率分别为30.56%，13.89%，22.22%和33.33%。(X2=8.0000，P=0.0047)，RSVA和RSVB在各季节中均有流行分布。68例观察组患儿1gG2、IgG4、IgM、IgE水平明显低于对照组(均P<0.05)，T细胞亚群CD3+，CD4+、CD4+/CD8+、CD19+水平均低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示病毒感染引发患儿机体内免疫功能紊乱。结论 儿童呼吸道感染病毒类型主要为呼吸道合胞病毒，冬季是病毒感染的流行季节。积极监测病毒感染情况，对抗病毒治疗具有指导意义。
【关键词】呼吸道感染;患儿;呼吸道合胞病毒;基因分型;免疫功能
[Abstract]
Obiective To analvze the clinical characteristics and immune function of pediatric patients with a respiratory tract infection in order to guide the clinical treatment of infection. Methods Sixty-eight children with a respiratorytract infection served as the observation group, and 74 healthy children served as the control group. The levels of immunoglobulins and T-cell subsets in children with an infection were analyzed. Nasopharyngeal aspiration samples from children with a respiratory tract infection were collected, the virus in the samples was determined qualitatively with direct fluorescence, and the clinical typing of respiratory syncytial virus (RSV) was accomplished via amplification with PCR Results Among the 68 pediatric patients with a respiratory tract infection, 36 were infected with an RSV. 11 were infec ted with a parainfluenza virus, 9 were infected with an adenovirus, 7 were infected with an influenza virus, 3 were infected with an enterovirus, and 2 had a mixed infection. Of the 36 pediatric patients infected with an RSV. 26 were infected with the RSVA subtype and 10 were infected with the RSVB subtype. Pediatric patients consisted of 25 males and 11 females. The rate of detection was 36.11% in children ages 0-1, 27.78% in children ages 1-3, 22.22% in children ages 3-6, and 13.89% in children ages 6-14. The status of the RSV infection differed significantly between children ages 0-1 and the other age groups (X2=5.5556, P=0.0184). RSVA and RSVB were distributed in children of different ages with a respir atory tract infection. RSV was detected at a rate of 30.56% in the spring, 13.89% in the summer, 22.22 % in the autumn, and 33.33% in the winter. The rate of detection in the winter differed significantly from that in other seasons (X2=8.0000, P=0.0047), RSVA and RSVB were distributed during all seasons. The levels of IgG2, IgG4, IgM, and IgE in the 68 children in the observation group were significantly lower than those in the control group, and levels differed significantly according to a t test (P<0.05 for all). The levels of CD3+, CD4+, CD4+/CD8+, and CD19+ cells in the childrer with a respiratory tract infection were significantly lower than those in the control group, and levels differed significantly according to a t test(P<0.05 for all)，suggesting that viral infection caused immune dysfunction in the children with an infection. Conclusion The type of virus causing a respiratory tract infection in children was mainly RSV, and viral imfections were prevalent during the winter. Active monitoring and treatment of viral infections is crucial.
[ Key words respiratory tract infection; pediatric patients; RSV; genotyping; immune function
呼吸道感染是儿童最常见临床疾病类型之一，临床病毒感染是患儿呼吸道感染的重要病原体，常见呼吸道病毒类型有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，腺病毒(adenovirus，ADV)，流感病毒(influenza virus，Inf)，副流感病毒(parainfluenza virus，Pinf)等[1]。目前，RSV是临床呼吸道感染患儿检出率较高的病原体。儿童发生RSV呼吸道感染患者，有两个典型特征，即RSV可以感染存在母体抗体保护的婴儿，并且可以导致儿童发生反复感染。有报道称[2]，RSV毒株变异是导致儿童发生反复RSV感染的主要原因，患儿再次感染RSV时，机体产生的免疫反应无法有效阻止变异病毒再次感染患者，因此积极监测儿童RSV呼吸道感染型别，对患儿RSV感染的有效临床防治具有重要意义。
材料与方法
1临床资料
收集医院就诊的呼吸道感染患儿临床资料68例，包括急性上呼吸道感染患儿、急性支气管炎患儿、急性喘息性支气管炎患儿、大叶性肺炎患儿、哮喘合并感染患儿等。同时选取74例健康体检儿童作为对照组。本研究已通过医院伦理委员会标准，患儿家长愿意接受此次调查，且已经签署知情同意书。
2主要试剂与仪器
病毒RNA小量提取试剂盒购自Qiagen公司;SuperScript TMII逆转录酶试剂盒购自Invitrogen公司;r-Taq聚合酶等分子试剂购自Takara公司;无水乙醇等试剂购自Sigma公司;琼脂糖购自Promega公司;低温离心机购自Eppendorf公司;PCR扩增仪、电泳仪购自Bio-Rad公司;流式细胞仪及试剂盒购自美国BD公司。
3病毒检测与分型
3.1 标本收集 收取入选患者在住院3d内或门诊就诊当天的标本，采用一次性无菌吸痰管，经患者鼻腔插至7~8cm至其咽部以下，负压吸取深部鼻咽抽吸物(NPA)1~2 ml，加入少量无菌生理盐水，置于无菌收集管中，于超净台中加入2 ml的病毒保护液，混匀。
病毒保护液由200 U/ml链霉素、200 U/ml青霉素、
200 U/ml两性霉素B以及0.125%的BSA液组成。
将样本存于-70℃低温冰箱，保存待测。
3.2 病毒检测 采用直接荧光定性检测样本中病毒。结果判定：200×显微镜观察，在每个视野中找到两个及以上的绿色荧光细胞，即判定为阳性，染色显示为暗红色的判定为阴性细胞;对于两种及以上病毒感染样本判定为混合感染。
3.3 PCR扩增分型 标本处理：室温解冻样本，高速涡旋振荡后，转至2ml EP管中，10 000 r/min(离心半径8.7 cm)离心5 min后，上清液用于病毒核酸提取。
病毒RNA提取：取140 pl样本上清液，加入RNA载体(AVL)，高速涡旋振荡15 s，室温条件下静置10 min后，10 000 r/min(离心半径8.7 cm)离心2min;加入560 pul无水乙醇，高速涡旋振荡15 s，10 000r/min(离心半径8.7 cm)离心5 min;取630 4l液体置于离心柱中，10 000 r/min离心2 min;加入500 plAW1洗液，10 000 r/min(离心半径8.7 cm)离心5min;加入500 ul AW2洗液，离心;加入60 pl AVE，室温放置1 min后10000 r/min(离心半径8.7 cm)离心5 min.
逆转录反应体系：取病毒总RNA液21 pl，随机引物1 p1，10 pmol/L dNTPs 2 pl，共24 pl，于65℃进行逆转录反应5 min;将反应液置于冰盒上，加入16pl反应液，即RNase Out 1 p1、SSII反转录酶1 pl.5×buffer 8 l、0.1 mol/L dTT 4 pl，ddH20 2 ul;逆转录反应条件：25 ℃ 12 min，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min即得cDNA模板液。
PCR扩增反应液：病毒CDNA液2.5 ul，r-Taq DNA聚合酶0.25 1l，dNTPs 2 4l，10 × buffer 2.5 gl，上下游引物各0.5 pl，ddH20补至25 pl;PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃延伸30s，72 ℃延伸45 s，40个循环;72 ℃终延伸5 min，引物序列见表1
3.4 PCR产物检测 取PCR扩增产物，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，在120 V电泳30 min后，经凝胶成像仪观察拍照。并将PCR产物送大连宝生物公司测序。
4免疫指标监测
在空腹状态下，抽取儿童肘静脉血5 ml，将其中3ml置于不抗凝的无菌试管中，离心后收集血清样本，低温保存待测。采用免疫散射比浊法，分析患者免疫球蛋白水平，采用流式细胞仪测定患者T细胞亚群表达水平。
5统计学分析
采用统计学软件，对数据进行统计学分析，卡方检验和1检验分析差异显著性，以P<0.05判定为差异显著性。
结果
1患儿呼吸道感染病毒类型
68例呼吸道感染患者中，感染呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、流感病毒、肠道病毒、混合型的患者分别为36，11.9.7、3和2例，占52.94%，16.18%、13.24%，10.29%、4.41%和2.94%。呼吸道合胞病毒是患儿呼吸道感染的主要病毒类型。
2 RSV不同型别感染患儿临床特征
36例RSV感染患儿中，RSVA亚型感染患者26例，RSVB亚型感染患者10例，A型是患儿呼吸道感染主要RSV型别。RSV感染者中男性患儿25例，女性11例，男性多于女性患儿，差异有统计意义(X210.8889，Р<0.05).不同年龄组患儿RSV感染情况见表2。随着年龄增长，RSV检出率呈下降趋势。其中0~岁患儿RSV检出率最高，为36.11%，1~，3~和6~14岁组患儿检出率分别为27.78%、22.22%和13.89%.0~1岁患儿是RSV易感人群，与其他年龄患者RSV感染情况相比，差统计意义(X2=5.5556，P=0.0184)，RSVA和RSVB在不同年龄呼吸道感染患儿中均有分布，并且，在0~1岁呼吸道感染患儿中仍以RSVA型为主要流行型别。
不同季节患儿RSV感染情况见表3。春夏秋冬四季患儿RSV检出率分别为30.56%、13.89%、22.22%和33.33%。冬季是呼吸道患儿发病的流行季节，与其他季节相比，差异有统计学意义(X2=8.0000，P=0.0047)，RSVA和RSVB在各季节中均有流行分布，但RSVA在流行季节(冬季)的检出率明显高于RSVB型。
3受试儿童免疫球蛋白水平
74例对照组和68例观察组儿童免疫球蛋白水平见表4。呼吸道感染患儿1gG2、IgG4，IgM、IgE水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示病毒感染引发患儿机体免疫能力降低。
4受试儿童T细胞亚群水平
74例对照组和68例观察组T细胞亚群水平见表5。呼吸道感染患儿CD3+.CD4+、CD4+/CD8+、CD19+水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示病毒感染引发患儿机体内免疫功能紊乱。
讨论
在世界范围内，呼吸道感染是威胁儿童健康的常见疾病，临床病毒感染是患儿常见病原体。本研究调查患儿呼吸道感染病毒类型发现，呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、流感病毒、肠道病毒等在临床呼吸道感染患儿中均有发现，其中呼吸道合胞病毒仍然占据主要地位。RSV是儿童呼吸道感染的最重要病原体之一，是引发儿童肺炎及毛细支气管炎疾病的主要病原。然而，目前还未研制出有效的疫苗可以预防RSV感染，因而积极监测临床感染，调查RSV呼吸道感染患儿临床特征，对预防RSV感染具有重要意义[3]。本研究调查中，监测到病毒混合感染样本，这可能是由于一种病毒侵入患儿体内，导致患儿发生病毒感染后，患儿呼吸道黏膜结构发生改变，更易于其他病毒侵入、定植导致的。对于病毒混合感染患者，患儿病情严重，抗感染治疗较难，应给予高度重视[]
RSV属于副粘病毒科肺炎病毒属，是单股负链的非节段性RNA病毒。RSV核苷酸至少编码10种特异性蛋白，如两个基质蛋白(M，M2)、三个跨膜蛋白(G、F、SH)、两个非结构蛋白(NS1.NS2)以及三个核衣壳蛋白(N，P、L)[]。目前，根据吸附蛋白(G)、磷蛋白(N)、和蛋白(N)、小疏水蛋白(SH)序列的变异数量及长度，可以将RSV分为A(RSVA)，B(RSVB)两个亚型[-]。本研究发现，尽管RSVA和RSVB型在儿童呼吸道感染患者样本中均有分布，但A型更多见。这可能是由于RSVA亚型变异程度比RSVB亚型高导致的]。本研究中，发生RSV呼吸道感染的患儿中，男性患儿居多，这与以往研究报道一致。并且，多数RSV呼吸道感染患者年龄小于1岁，随着年龄增长，患儿RSV感染率降低。这是由于小于1岁的患儿机体免疫能力尚未发育完善，无法及时形成充足的抗体清除病毒，导致患者病毒感染阳性率较高[10.RsV流行具有明显的季节性分布特征，冬季是RsV流行高峰期，春秋季节次之，夏季RSV呼吸道感染发病率最低;另外，RSVA在感染流行季节中比RSVB分布率高，这可能与RSVB可以激发患者更完全或更持续的特异性免疫反应有关[
反复呼吸道感染在儿科患者中较为常见，发病率高达20%，患儿病情容易反复发作，机体长期处于免疫功能低的状态，严重影响儿童器官、系统的正常发育及功能[12，随着儿童年龄增长，其机体免疫力增强，临床发病率降低，因而儿童机体免疫功能紊乱等因素是导致儿童反复呼吸道感染发病的重要影响因素[1-1]，呼吸道感染患儿体内免疫水平降低，表明患儿体液免疫功能紊乱。与对照组相比，呼吸道感染患儿体内的1gG2.lgG4、IgM、IgE水平明显降低，表明呼吸道感染患儿体内存在免疫缺陷。有报道称[，1gG2，IgG4免疫缺陷是患儿呼吸道感染反复发作的主要机制。因此，积极监测患儿体内免疫球蛋白水平，重视1gG2、IgG4等引起的免疫缺陷患者，可以有效预防患儿发生反复呼吸道感染。反复呼吸道感染患儿体内T细胞亚群监测结果表明，与对照组相比，呼吸道感染患儿体内CD3、CD4以及CD4+/CD8水平显著降低，表明T淋巴细胞免疫功能降低。这是由于病毒侵入并感染宿主机体时，宿主免疫功能被削弱。因此，呼吸道感染患儿发生病毒感染后，其机体内体液免疫或细胞免疫功能紊乱，积极监测免疫功能指标可以降低临床i复呼 i感染k生
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